本發(fā)明屬于茶葉質(zhì)量真?zhèn)舞b別技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于手性指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的茶葉快速鑒別方法。

背景技術(shù)：

茶葉是世界上三大無(wú)酒精飲料之一，具有芬芳馥郁的香氣，豐富甘醇的滋味，含有茶多酚、氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并具有抗氧化、防輻射、抗菌及防癌等多種保健功能，得到了世界人民的廣泛喜愛(ài)。由于各地的茶樹(shù)品種以及加工工藝等因素的巨大差異，目前市面上流通的茶葉種類十分豐富，受歡迎程度也因人而異。近年來(lái)，隨著消費(fèi)水平的提高，茶產(chǎn)業(yè)得到了繁榮發(fā)展，各地對(duì)本土品牌的保護(hù)意識(shí)也日益加強(qiáng)，創(chuàng)建了不少以地名為商標(biāo)的茶葉品牌，如福鼎白茶、云南滇紅、英德紅茶、西湖龍井、鳳凰單樅及君山銀針等。然而，由于采用類似加工工藝的茶葉往往在外觀上都無(wú)明顯差別，給了黑心商家可乘之機(jī)，低價(jià)收購(gòu)次等茶葉并貼上品牌茗茶標(biāo)簽的現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮，給茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了較大的阻礙，亟需一種可靠有效的鑒別手段來(lái)區(qū)分知名茶葉品牌的真?zhèn)巍Ｄ壳?，主流的鑒別手段是感官審評(píng)技術(shù)，茶葉感官審評(píng)是審評(píng)員在規(guī)定的審評(píng)室內(nèi)、利用規(guī)定的審評(píng)器具，通過(guò)自身的觸覺(jué)、視覺(jué)、聞?dòng)X、味覺(jué)來(lái)審評(píng)茶葉的外形、湯色、香氣、滋味、葉底，然后綜合得分，判定茶葉的品質(zhì)。然而，感官審評(píng)技術(shù)結(jié)果的可靠性除了受評(píng)茶人員本身素質(zhì)水平和敏銳的審辨能力影響外，還受諸多外界客觀因素的影響，很難在短時(shí)間內(nèi)完成大批量茶樣的檢驗(yàn)工作，也難以提供一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判定茶葉的真?zhèn)?。因此，在日益重視消費(fèi)者權(quán)利及品牌保護(hù)意識(shí)的當(dāng)前，急需一種簡(jiǎn)便、環(huán)境可適性強(qiáng)且結(jié)果客觀準(zhǔn)確的分析方法來(lái)實(shí)現(xiàn)茶葉的快速鑒別。

手性色譜分析技術(shù)是目前藥物、生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域中的重要課題，是當(dāng)前分離分析的熱點(diǎn)，其原理是通過(guò)用手性固定相或在流動(dòng)相中加入手性添加劑，來(lái)分離、分析樣本中含有的對(duì)映異構(gòu)體。近年來(lái)，來(lái)自食品或生命科學(xué)領(lǐng)域的大量研究表明，植物體或食品的重要手性化學(xué)成分的對(duì)映異構(gòu)體比例與其品種、產(chǎn)地及加工方式等有密切的關(guān)系，目前已有國(guó)外的研究小組將手性分析技術(shù)運(yùn)用于蜂蜜及精油等產(chǎn)品的溯源或真?zhèn)舞b別上。受此啟發(fā)，可以采用手性色譜分析技術(shù)測(cè)定目標(biāo)茶葉中某些重要化學(xué)組分的對(duì)映異構(gòu)體組成比例，從而獲得其特定的手性分布信息，組成手性指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，以實(shí)現(xiàn)快速鑒定茶葉真?zhèn)蔚哪康?。然而，由于手性分析技術(shù)在茶葉領(lǐng)域仍處于初步發(fā)展階段，目前還未有采用該技術(shù)的茶葉真?zhèn)舞b別的相關(guān)的文獻(xiàn)或?qū)＠麍?bào)道。此外，雖然目前已有使用其它分析方法的茶葉真?zhèn)舞b別方法，但往往需要建立統(tǒng)計(jì)分析模型，模型需建立在大量的樣本分析基礎(chǔ)上，且需要多類別茶葉進(jìn)行比較，通過(guò)大數(shù)據(jù)的差異性分析來(lái)判別茶葉的特征屬性。相比之下，本發(fā)明所采用的手性分析方法，僅需知道茶葉中部分關(guān)鍵化合物的對(duì)映異構(gòu)體比例值，即可快速判斷出茶葉的真?zhèn)螝w屬。

茶葉的宜人香氣由成千上萬(wàn)種揮發(fā)性成分組成，大部分揮發(fā)性化合物在茶葉中的絕對(duì)含量很少，其總量一般只占干物質(zhì)的0.01%～0.05%。萜烯醇類化合物如芳樟醇、芳樟醇氧化物、檸檬烯及松油醇等在大部分茶葉中具有較高的含量，在1克成茶樣中可達(dá)到0.1-10 μg，對(duì)成品茶香氣品質(zhì)的形成起著至關(guān)重要的作用。它們均含有手性結(jié)構(gòu)，其對(duì)映異構(gòu)體組成與茶葉的產(chǎn)地、品種及類別有著密切聯(lián)系。因此，以上化合物是建立特征性手性指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的適宜研究對(duì)象。目前，在茶葉真?zhèn)舞b別領(lǐng)域還未有相關(guān)的研究或?qū)＠麍?bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明旨在提供一種快速、直觀的茶葉真?zhèn)舞b別方法。本發(fā)明采用手性色譜分析技術(shù)，無(wú)需精確定量，僅需查明茶葉中若干種揮發(fā)性成分的對(duì)映異構(gòu)體比例關(guān)系，建立相應(yīng)的手性指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，即可用于鑒別某些特定類別茶葉的真?zhèn)?。目前?jīng)發(fā)明者驗(yàn)證，可用于福鼎大白茶、印尼白茶、英紅九號(hào)、云南滇紅及伯爵紅茶等國(guó)內(nèi)外著名茶葉的真?zhèn)舞b別。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

所述的一種基于手性指紋數(shù)據(jù)的茶葉真?zhèn)慰焖勹b別方法，其特征包括以下步驟：

1）手性揮發(fā)性成分的對(duì)映異構(gòu)體分離

取芳樟醇、芳樟醇氧化物A、芳樟醇氧化物B、芳樟醇氧化物C、芳樟醇氧化物D、檸檬烯及α-松油醇各對(duì)映異構(gòu)體或其混合物的標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜級(jí)乙醚稀釋，配制成100 ng/g的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，建立混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的手性氣相色譜法分析方法，并記錄已分離化合物的保留時(shí)間及特征離子；

2）待鑒定茶葉揮發(fā)性成分的提取

采用頂空固相微萃取法提取茶葉的香氣成分，并采用已建立的手性氣相色譜法分析香氣成分，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定性，并計(jì)算相應(yīng)的對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量值，即Ee值；

3）茶葉的真?zhèn)舞b別

將步驟2）獲得的Ee值數(shù)據(jù)與已建立的手性指紋譜庫(kù)比對(duì)，若數(shù)據(jù)超出數(shù)據(jù)庫(kù)參考值范圍則可鑒定為假冒產(chǎn)品。

所述的一種基于手性指紋數(shù)據(jù)的茶葉真?zhèn)慰焖勹b別方法，其特征在于：所述步驟1）中手性氣相色譜法分析方法具體包括：

儀器型號(hào)：Agilent 7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀；氣相條件：CP7500CP-Cyclodextrin手性色譜柱；進(jìn)樣口溫度為220 oC，傳輸線溫度為250 oC；進(jìn)樣量為1.0 μL，分流進(jìn)樣，分流比為10:1；載氣為純度≥99.99％氦氣，流速為1.2 mL/min；柱溫箱采用程序升溫：50 oC保持2 min，然后以2 oC/min升到120 oC保持10 min，再以4 oC/min升到180 oC保持5 min；質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量-70 eV；離子源溫度220 oC；質(zhì)量掃描范圍m/z 33-600 u。

所述的一種基于手性指紋數(shù)據(jù)的茶葉真?zhèn)慰焖勹b別方法，其特征在于：所述步驟2）頂空固相微萃取法具體包括：

準(zhǔn)確稱取樣品1.00 g至250 mL頂空萃取瓶中，加入5.0 mL沸水沖泡，放入50 oC水浴鍋平衡5.0 min，然后插入裝有DVB/CAR/PDMS萃取頭的手動(dòng)SPME手柄在50 oC水浴條件下頂空萃取，萃取時(shí)間為30 min，取出后立即插入GC-MS進(jìn)樣口中解吸附3.0 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器收集數(shù)據(jù)；

采用的對(duì)Ee值計(jì)算方法如下：

Ee % = [(A1-A2)/(A1+A2)]×100%；

式中：A1為目標(biāo)化合物某一種特定的對(duì)映異構(gòu)體的特征離子色譜峰面積，A2為另一對(duì)映異構(gòu)體的特征離子色譜峰面積，所選特征離子為相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜中豐度最高的離子；正負(fù)ee值代表了相反立體構(gòu)型的目標(biāo)化合物，ee值絕對(duì)值越高，代表A1對(duì)應(yīng)的該立體構(gòu)型的目標(biāo)化合物在茶樣中的比例也越高；當(dāng)ee = 0% 時(shí)，代表兩種異構(gòu)體在茶樣中的比例相同，為消旋體；反之，當(dāng)ee =±100% 時(shí)，代表在茶樣中僅存在單一立體構(gòu)型的目標(biāo)化合物。

所述的一種基于手性指紋數(shù)據(jù)的茶葉真?zhèn)慰焖勹b別方法，其特征在于：所述步驟3）中建立的茶葉的手性指紋數(shù)據(jù)庫(kù)包含福鼎大白茶、印尼白茶、英紅9號(hào)、云南滇紅和伯爵紅茶，如下表所示：

注：當(dāng)Ee>0%時(shí)，芳樟醇的主要構(gòu)型為S構(gòu)型；芳樟醇氧化物A的主要構(gòu)型為(2S, 5S)；芳樟醇氧化物B的主要構(gòu)型為(2S, 5R)；芳樟醇氧化物C的主要構(gòu)型為(2S, 5R)；芳樟醇氧化物D的主要構(gòu)型為(2S, 5S)；檸檬烯的主要構(gòu)型為S構(gòu)型；α-松油醇的主要構(gòu)型為S構(gòu)型。數(shù)據(jù)表中“-”表示該數(shù)據(jù)在相應(yīng)茶類中與其它茶類無(wú)顯著差異，或在該茶類中未被檢出，可不做要求。

本發(fā)明的上述技術(shù)方案有以下幾方面優(yōu)點(diǎn)：1）在分析方法上首次將手性氣相色譜技術(shù)運(yùn)用于茶葉的真?zhèn)舞b別領(lǐng)域，無(wú)需全組分分析，僅需測(cè)定茶葉中7種標(biāo)志性手性揮發(fā)性成分的對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量值，比對(duì)手性指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，即可有效鑒別出茶葉的真?zhèn)危?）排除了人為主觀因素，提供統(tǒng)一量化數(shù)據(jù)，無(wú)需專業(yè)高端人才即可完成檢驗(yàn)，大大降低鑒定成本；3）數(shù)據(jù)分析迅速便捷，無(wú)需繁瑣統(tǒng)計(jì)分析軟件，無(wú)需頻繁校正數(shù)據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1為混合茶樣中揮發(fā)性成分的定性色譜圖，其中A為混合茶樣香氣成分的總離子流圖，B為檸檬烯對(duì)映異構(gòu)體的特征離子提取色譜圖，C為芳樟醇對(duì)映異構(gòu)體的特征離子提取色譜圖，D為芳樟醇氧化物A-B的特征離子提取色譜圖，E為α-松油醇的特征離子提取色譜圖，F(xiàn)為芳樟醇氧化物C-D的特征離子提取色譜圖；

圖2為福鼎白茶及對(duì)照茶樣中檸檬烯的對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量值分布圖；

圖3為福鼎白茶及對(duì)照茶樣中芳樟醇的對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量值分布圖；

圖4為福鼎白茶及對(duì)照茶樣中芳樟醇氧化物A的對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量值分布圖；

圖5為福鼎白茶及對(duì)照茶樣中芳樟醇氧化物B的對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量值分布圖；

圖6為福鼎白茶及對(duì)照茶樣中芳樟醇氧化物C的對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量值分布圖；

圖7為福鼎白茶及對(duì)照茶樣中芳樟醇氧化物D的對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量值分布圖；

圖8為福鼎白茶及對(duì)照茶樣中α-松油醇的對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量值分布圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)例及附圖來(lái)對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說(shuō)明。本實(shí)例僅用于具體說(shuō)明該方法，而并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制，任何依照本發(fā)明的教導(dǎo)所做出的改動(dòng)或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：福鼎大白茶的手性指紋數(shù)據(jù)庫(kù)建立

具體操作步驟：1）收集代表性福鼎大白茶20個(gè)，其它茶葉對(duì)照樣本20個(gè)，且參照樣本分別來(lái)自不同的品種、類別，種類豐富。

2）揮發(fā)性成分標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)映異構(gòu)體分離

購(gòu)買市售的R-芳樟醇、芳樟醇消旋體、呋喃型芳樟醇氧化物（A、B混合物）、吡喃型芳樟醇氧化物（C、D混合物）、R-α-松油醇、S-α-松油醇、R-檸檬烯及S-檸檬烯，以乙醚為溶劑，配成100 ng/g的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，對(duì)上述標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行手性GC-MS分析，記錄保留時(shí)間及相應(yīng)特征離子峰。

分析方法如下：儀器型號(hào)：Agilent 7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）。氣相條件：CP7500CP-Cyclodextrin手性色譜柱（50 m×0.25 mm×0.25 μm，美國(guó)Agilent公司）；進(jìn)樣口溫度為220 oC，傳輸線溫度為250 oC；進(jìn)樣量為1.0 μL，分流進(jìn)樣，分流比為10:1；載氣為高純度氦氣（純度≥99.99％），流速為1.2 mL/min；柱溫箱采用程序升溫：50 oC保持2 min，然后以2 oC/min升到120 oC保持10 min，再以4 oC/min升到180 oC保持5 min。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量-70 eV；離子源溫度220 oC；質(zhì)量掃描范圍m/z 33-600 u。

表1：揮發(fā)性化合物標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)映異構(gòu)體分離

注：括號(hào)里的特征離子為相應(yīng)化合物中豐度最高的離子，其提取離子峰面積用于測(cè)算Ee值。

3）茶葉中揮發(fā)性成分的手性GC-MS分析

采用頂空固相微萃取法（HS-SPME）提取茶葉的香氣組分，采用與標(biāo)準(zhǔn)品相同的GC-MS條件分析該香氣組分。

頂空固相微萃取法條件：準(zhǔn)確稱取樣品1.00 g至自制的250 mL頂空萃取瓶中，加入5.0 mL沸水沖泡，放入50 oC水浴鍋平衡5.0 min，然后插入裝有DVB/CAR/PDMS萃取頭的手動(dòng)SPME手柄在50 oC水浴條件下頂空萃取，萃取時(shí)間為30 min，取出后立即插入GC-MS進(jìn)樣口中解吸附3.0 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器收集數(shù)據(jù)。

4）福鼎大白茶的手性指紋數(shù)據(jù)庫(kù)建立

選定目標(biāo)化合物的兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體保留時(shí)間前后2分鐘范圍內(nèi)的色譜峰段，提取表2中的特征離子，若所有的特征離子集中在某個(gè)波峰，則該峰可被鑒定為目標(biāo)化合物，每個(gè)化合物在茶樣里的定性色譜圖如圖1所示。20個(gè)福鼎大白茶樣中檸檬烯、芳樟醇、芳樟醇氧化物A-D及α-松油醇的Ee值通過(guò)下列公式計(jì)算獲得：Ee (%) = [(A1-A2)/(A1+A2)]×100%；式中：A1為目標(biāo)化合物某一種特定的對(duì)映異構(gòu)體的特征離子色譜峰面積，A2為另一對(duì)映異構(gòu)體的特征離子色譜峰面積（所選特征離子為相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜中豐度最高的離子）。將獲得的目標(biāo)化合物的對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量值數(shù)據(jù)導(dǎo)入EXCEL表內(nèi)，建立福鼎大白茶的手性指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)取自20個(gè)茶樣的平均值，由于各臺(tái)儀器的性能響應(yīng)不一，在數(shù)值上會(huì)有一定偏差，因此選取的正負(fù)偏差應(yīng)適當(dāng)放寬（一般為±5-20%）。為了驗(yàn)證福鼎大白茶手性指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的準(zhǔn)確性，也將對(duì)照茶樣的數(shù)據(jù)導(dǎo)入EXCEL表內(nèi)，并繪制柱狀圖，如圖2-8所示，福鼎大白茶的檸檬烯、芳樟醇、芳樟醇氧化物A-D以及α-松油醇的Ee值具有高度的一致性，且與其它對(duì)照茶樣的相應(yīng)數(shù)據(jù)有顯著性差異，有力地證明了該手性指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的準(zhǔn)確性高，特異性強(qiáng)。

實(shí)施例2-6：印尼白茶、英紅9號(hào)、云南滇紅以及伯爵紅茶的手性指紋數(shù)據(jù)庫(kù)建立

與實(shí)施例1類似，在此不再贅述。印尼白茶、英紅9號(hào)、云南滇紅以及伯爵紅茶所建立的手性指紋數(shù)據(jù)如表2所示。

表2印尼白茶、英紅9號(hào)、云南滇紅以及伯爵紅茶手性指紋數(shù)據(jù)

實(shí)施例7：實(shí)際樣本（英紅9號(hào)樣本及伯爵紅茶）的真?zhèn)舞b定

1）采用頂空固相微萃取法提取英紅9號(hào)及伯爵紅茶的香氣成分，為保證數(shù)據(jù)穩(wěn)定性，做技術(shù)重復(fù)3次。

2）根據(jù)芳樟醇、芳樟醇氧化物A-D、檸檬烯及α-松油醇的特征離子峰，確定其出峰位置，并提取相表2中的選擇離子測(cè)算兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體的峰面積，根據(jù)Ee (%) = [(A1-A2)/(A1+A2)]×100%計(jì)算出相應(yīng)化合物的Ee值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示：

表3：待鑒定英紅9號(hào)和伯爵紅茶中手性揮發(fā)性成分的Ee值

3）英紅9號(hào)及伯爵紅茶的真?zhèn)舞b定

將獲得的手性揮發(fā)性成分的Ee值與英紅9號(hào)及伯爵紅茶的手性指紋數(shù)據(jù)庫(kù)里的參考值比對(duì)，發(fā)現(xiàn)待鑒定英紅9號(hào)里的芳樟醇Ee值不在參考值范圍之內(nèi)，甚至主導(dǎo)的構(gòu)型也相反，說(shuō)明該英紅9號(hào)為假冒或摻假產(chǎn)品；而伯爵紅茶的各個(gè)指標(biāo)均在庫(kù)中參考值范圍內(nèi)，說(shuō)明該伯爵紅茶應(yīng)該不屬于假冒產(chǎn)品。

綜上所述，采用手性氣相色譜分析技術(shù)，無(wú)需精確定量，僅需與本發(fā)明建立的手性指紋數(shù)據(jù)庫(kù)參考值比對(duì)，即可快速鑒別福鼎大白、印尼白茶、英紅9號(hào)及伯爵紅茶的真?zhèn)?。若需鑒別更多其它類別茶葉，可以依照本發(fā)明的指導(dǎo)建立手性指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。