本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種仿刺參性別鑒定方法。
背景技術(shù)：
：仿刺參屬于無脊椎動物棘皮動物門，是我國近海最主要的增養(yǎng)殖經(jīng)濟品種之一。仿刺參在育苗生產(chǎn)過程中，雄性種參與雌性種參的比例?？刂圃?/10～1/2范圍內(nèi)，雄性種參與雌性種參的比例過高反而會影響受精卵的孵化，因此在種參的選擇上對雄性種參的數(shù)量需求相對較少。然而，仿刺參雖為雌雄異體生物，但雌性和雄性個體外觀無明顯差異，無法利用肉眼通過參體外觀判定仿刺參性別，只能通過活體解剖觀察性腺或排精產(chǎn)卵后觀察精卵來判定仿刺參性別。在仿刺參育苗生產(chǎn)中，育苗企業(yè)購買種參時只能對性別不加選擇的購買，技術(shù)人員主要通過種參排精產(chǎn)卵后的精和卵來判定種參性別，并在排精產(chǎn)卵時對種參性別比例加以控制。在不明顯傷害仿刺參和未排精產(chǎn)卵的情況下實現(xiàn)仿刺參性別的鑒定成為仿刺參育苗生產(chǎn)中的重要技術(shù)瓶頸。這一技術(shù)瓶頸導(dǎo)致仿刺參育苗生產(chǎn)中購買的雄性種參數(shù)量遠超過育苗生產(chǎn)需求量。由于種參通常采用單價高昂的外海野生采捕仿刺參，因此在種參的購買和暫養(yǎng)這些環(huán)節(jié)上，仿刺參育苗企業(yè)浪費了較多成本。除了仿刺參的育苗生產(chǎn)，有關(guān)仿刺參的一些科學(xué)研究也有大量的性別鑒定需要。近年來有報道通過醫(yī)用超聲波掃描儀對仿刺參性腺進行掃描檢查從而判定仿刺參性別，但該方法存在設(shè)備要求高、結(jié)果的獲取和分析需要具有較強影像醫(yī)學(xué)專業(yè)背景的人員來完成、不利于在生產(chǎn)和研究中推廣等問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，提供一種對仿刺參無明顯傷害、可簡便、準確鑒定性腺已發(fā)育仿刺參性別的技術(shù)方法，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下具體步驟：其通過SDS-PAGE分離仿刺參體腔液上清中的蛋白，通過native-PAGE分離仿刺參體腔細胞破碎液上清中的蛋白，根據(jù)SDS-PAGE凝膠圖譜和native-PAGE后的酚氧化酶酶譜鑒定仿刺參的性別，所述雄性仿刺參體腔液上清SDS-PAGE凝膠圖譜中含有50kDa的蛋白條帶，所述雌性仿刺參體腔細胞破碎液上清的酚氧化酶酶譜中含3條酚氧化酶條帶。具體的，對于上述技術(shù)方案中，所述的仿刺參體腔液用滅菌注射器從仿刺參腹部抽取，體腔液用量100μL。具體的，對于上述技術(shù)方案中，所述的仿刺參體腔液上清通過離心法獲得，離心條件為4℃，3500rpm，5min。具體過程為：將100μL仿刺參體腔液離心后取上清，將獲得的體腔液上清進行SDS-PAGE時使用含50kDa蛋白條帶的蛋白Marker。具體的，對于上述技術(shù)方案中，所述的仿刺參體腔細胞破碎液上清通過4℃、3500rpm離心5min、10μL蒸餾水重懸、-20℃凍融2次、再4℃、12000rpm離心5min制備。具體過程為：用100μL仿刺參體腔液制備體腔細胞破碎液上清，將制備的體腔細胞破碎液上清進行native-PAGE。具體的，對于上述技術(shù)方案中所述的SDS-PAGE凝膠為丙烯酰胺濃度為4％～6％的濃縮膠和濃度為10％～12％的分離膠。具體的，對于上述技術(shù)方案中所述的native-PAGE凝膠為丙烯酰胺濃度為4％～6％的濃縮膠和濃度為10％～12％的分離膠。具體的，對于上述技術(shù)方案中，所述的SDS-PAGE的電泳條件為30mA恒電流電泳0.5h后60mA恒電流電泳至溴酚藍指示劑出膠。再使用考馬斯亮藍R250染色液染色，并經(jīng)脫色液脫色。具體的，對于上述技術(shù)方案中，所述的native-PAGE的電泳條件為20mA恒電流電泳3.0h。再使用1.5％鄰苯二酚溶液發(fā)色。具體的，對于上述技術(shù)方案中，根據(jù)SDS-PAGE凝膠中是否含有50kDa蛋白條帶以及native-PAGE后酚氧化酶酶譜中的酚氧化酶條帶數(shù)量確定仿刺參性別。根據(jù)檢測結(jié)果進行判定的規(guī)則有3種：①具有50kDa蛋白條帶，不具有3條酚氧化酶條帶，判定為雄性；②不具有50kDa蛋白條帶，具有3條酚氧化酶條帶，判定為雌性；③不具有50kDa蛋白條帶，也不具有3條酚氧化酶條帶，無法判定性別。具體的，對于上文所述的SDS-PAGE中使用的試劑如下：所述的電泳緩沖液為Tris-甘氨酸(含SDS)緩沖液(3.03gTris；14.41g甘氨酸；1gSDS；1L蒸餾水)。所述的考馬斯亮藍R250染色液為考馬斯亮藍R250甲醇乙酸溶液(2.5g考馬斯亮藍R250；500mL甲醇；50mL乙酸；加蒸餾水定容至1L)所述的脫色液為甲醇乙酸溶液(100mL甲醇；50mL乙酸；加蒸餾水定容至1L)。具體的，對于上文所述的native-PAGE中使用的試劑如下：所述的電泳緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖液(3.03gTris；14.41g甘氨酸；1L蒸餾水)。所述的1.5％鄰苯二酚溶液為鄰苯二酚水溶液(1.5g鄰苯二酚；100mL蒸餾水)。通過大量研究發(fā)現(xiàn)，在性腺已發(fā)育的仿刺參中，雄性仿刺參體腔液上清的SDS-PAGE結(jié)果中存在一條50kDa的蛋白條帶，而雌性仿刺參體腔細胞破碎液上清的native-PAGE后酚氧化酶酶譜結(jié)果中存在3條酚氧化酶條帶。以50kDa的蛋白和酚氧化酶譜帶為生物標(biāo)志物，通過SDS-PAGE和酚氧化酶酶譜的方法可實現(xiàn)對性腺已發(fā)育的仿刺參的性別鑒定。本發(fā)明的優(yōu)點在于：①從仿刺參體腔中取100μL體腔液即可滿足性別鑒定需要，對刺參的傷害極??；②通過SDS-PAGE以及native-PAGE后的酚氧化酶酶譜實現(xiàn)仿刺參性別的鑒定，試劑、設(shè)備和技術(shù)要求簡單，操作簡便，結(jié)果直觀；③速度快、效率高，可對大量樣品進行批量檢測；④使用兩種技術(shù)分別鑒定雄性和雌性仿刺參，準確率高(90％以上)。附圖說明圖1為本發(fā)明的仿刺參性別鑒定方法對仿刺參樣品的性別鑒定的部分結(jié)果。圖2為本發(fā)明的仿刺參性別鑒定方法對仿刺參樣品的性別鑒定的部分結(jié)果。具體實施方式下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思進行等同替換或改變均屬于本發(fā)明保護范疇。實施例12015年6月19日和2015年6月23日在分別在遼寧的興城和金州兩個地區(qū)各取仿刺參40只，體重分別為215±28.8g和264±22.5g，暫養(yǎng)至2015年6月25日使用。(1)制備體腔液上清和體腔細胞破碎液上清用滅菌注射器穿透仿刺參的腹部抽取體腔液100μL，離心(4℃，3500rpm，5min)，取上清作為體腔液上清；取細胞沉淀用10μL蒸餾水重懸，-20℃凍融2次，離心(4℃，12000rpm，5min)取上清，作為體腔細胞破碎液上清。(2)以體腔液上清為樣品進行SDS-PAGE和雄性鑒定①配制Tris-甘氨酸(含SDS)緩沖液(3.03gTris，14.41g甘氨酸，1gSDS，1L蒸餾水)。②配制丙烯酰胺濃度為12％的分離膠和濃度為5％的濃縮膠。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠配方如表1所示：表1SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠配方③將體腔液上清與SDS-PAGE上樣緩沖液按1:1(v:v)比例混勻，沸水浴5min，制備成SDS-PAGE上樣樣品。SDS-PAGE上樣緩沖液配方如表2所示：表2SDS-PAGE上樣緩沖液配方④濃縮膠上樣孔中每孔加SDS-PAGE上樣樣品20μL，使用含50kDa蛋白條帶的蛋白Marker，30mA恒電流電泳0.5h后60mA恒電流電泳至溴酚藍指示劑出膠(4℃環(huán)境下)。⑤使用考馬斯亮藍R250染色液對聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白條帶進行染色0.5h?？捡R斯亮藍R250染色液配方如表3所示：表3考馬斯亮藍R250染色液配方試劑考馬斯亮藍R250甲醇乙酸蒸餾水質(zhì)量或體積2.5g500mL50mL定容至1L⑥使用脫色液對考馬斯亮藍R250染色后的聚丙烯酰胺凝膠進行脫色2小時。脫色液配方如表4所示：表4脫色液配方試劑甲醇乙酸蒸餾水體積100mL50mL定容至1L⑦對比蛋白Marker判定仿刺參是否為雄性。(3)以體腔細胞破碎液上清為樣品進行native-PAGE和雌性鑒定①配制Tris-甘氨酸緩沖液(3.03gTris，14.41g甘氨酸，1L蒸餾水)。②配制丙烯酰胺濃度為10％的分離膠和濃度為5％的濃縮膠。Native-PAGE聚丙烯酰胺凝膠配方如表5所示：表5native-PAGE聚丙烯酰胺凝膠配方③將體腔液上清與native-PAGE上樣緩沖液按1:1(v:v)比例混勻，制備成native-PAGE上樣樣品。Native-PAGE上樣緩沖液配方如表6所示：表6native-PAGE上樣緩沖液配方④濃縮膠上樣孔中每孔加native-PAGE上樣樣品20μL，20mA恒電流電泳3.0h(4℃環(huán)境下)。結(jié)果分析：圖1和圖2表示實施例中仿刺參性別鑒定的部分結(jié)果。圖1中，泳道1為蛋白Marker，泳道2～5分別為4只雌性仿刺參的體腔液上清，泳道6～9分別為4只雄性仿刺參的體腔液上清。雄性仿刺參體腔液上清中含有分子量為50kDa的蛋白條帶，而雌性仿刺參體腔液上清中不含有該蛋白條帶。圖2中，泳道1～4分別為4只雌性仿刺參的體腔細胞破碎液上清，泳道5～8分別為4只雄性仿刺參的體腔細胞破碎液上清。雌性仿刺參體腔細胞酚氧化酶酶譜含有3條帶，而雄性仿刺參體腔細胞酚氧化酶酶譜含有2條帶。實施例中有3種結(jié)果，①具有50kDa蛋白條帶，不具有3條酚氧化酶條帶，判定為雄性；②不具有50kDa蛋白條帶，具有3條酚氧化酶條帶，判定為雌性；③不具有50kDa蛋白條帶，也不具有3條酚氧化酶條帶，無法判定性別，按鑒定錯誤計算。對比解剖觀察性腺得到的仿刺參性別鑒定結(jié)果，實施例對仿刺參樣品的性別鑒定準確率如下：在興城地區(qū)所采的40個仿刺參樣品中，性別鑒定準確率為92.5％；在金州地區(qū)所采的40個仿刺參樣品中，性別鑒定準確率為95％。實施例結(jié)果表明，本發(fā)明的方法可快速、大量、準確的鑒定仿刺參的性別，且操作簡便，試劑、設(shè)備和技術(shù)要求低，易于在生產(chǎn)和研究中推廣應(yīng)用。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會理解，在本發(fā)明的技術(shù)方案內(nèi)，對于上述實施例進行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3