本發(fā)明屬于電化學生物傳感領域，具體涉及一種二硫化鉬納米片電化學傳感器及其制備方法與應用。

背景技術：

目前用于細胞檢測的方法有多種，例如免疫細胞化學法、PCR技術、電化學法及微流控裝置等。盡管這些方法靈敏度較高，并廣泛應用于實驗室檢測及醫(yī)院臨床診斷，但多數(shù)方法需要先進的儀器設備及復雜的操作過程、耗時耗力，不適用于快速檢測。因此，簡單、快速的檢測方法仍需進一步研究。近年來，隨著納米技術的發(fā)展，納米材料在生物傳感器的研制方面得到廣泛應用，為細胞傳感器的研究開創(chuàng)了新的局面。傳感界面的構建與修飾是制備細胞傳感器的核心和關鍵步驟，直接影響到細胞傳感器的響應靈敏度、線性范圍和使用壽命等。利用納米材料的表面效應、尺寸效應和量子效應，將不同結(jié)構與形態(tài)的納米材料如納米顆粒、納米管、納米線或納米材料的復合物引入生物敏感界面的構建中，能夠顯著提高生物傳感器的檢測性能。因此，引入不同結(jié)構的納米材料，構建理想的細胞傳感界面，進而獲得性能優(yōu)良的細胞傳感器是傳感器領域的研究熱點和研究者探索的主要目標之一。近十年來，石墨烯在生物傳感器領域的應用研究得到科學家們的極大關注與，作為石墨烯的結(jié)構類似物，MoS₂具有二維層狀結(jié)構，性能獨特，有著大的表面積、良好的電子流動性和高電子態(tài)密度，表現(xiàn)出優(yōu)異的電化學傳感性能。當前MoS₂納米片制備的生物傳感器主要用于檢測乙酰氨基酚、葡萄糖、多巴胺、DNA等生物分子。(Adv.Funct.Mater.2015,25,5086；Chem.Soc.Rev.2015,44,4433；Chem.Soc.Rev.2013,42,5944；Anal.Chem.2015,87,230；Small 2013,9,1160；Electroanal.2010,22,1027；Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,2114；ACS Sens.2016,1,5；Nat.Chem.2013,5,263；Nat.Nanotechnol.2012,7,699；Small 2014,10,1101；Biosens.Bioelectron.2015,74,227；Biosens.Bioelectron.2014,55,195；Nanoscale 2014,6,11971；Anal.Chem.2014,86,12064；Anal.Chem.2013,85,10289；Sci.Rep.2016,6,34587；Sci.Rep.2014,4；J.Phys.Chem.C 2011,115,13303；J.Am.Chem.Soc.2013,135,4584；Chem.Mater.2014,26,5892)。但MoS₂對于細胞的直接檢測文獻報道仍然較少，同時對于傳感界面的構建存在界面構建復雜、生物相容性差、靈敏度低等問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于提出一種二硫化鉬納米片電化學傳感器。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述二硫化鉬納米片電化學傳感器的制備方法。該方法是利用硫脲修飾的二硫化鉬納米片與多肽連接，用簡單便捷的修飾方式構建傳感界面，獲得電化學傳感器；該方法簡單易控、經(jīng)濟合理。

本發(fā)明的又一目的在于提供所述二硫化鉬納米片電化學傳感器的應用。

本發(fā)明目的通過以下技術方案實現(xiàn)：一種二硫化鉬納米片電化學傳感器，包括玻碳電極基底、電極引線和絕緣層，所述的玻碳電極基底表面涂覆有硫脲修飾的二硫化鉬納米片，所述的硫脲修飾的二硫化鉬納米片與GE11多肽連接。

所述的硫脲修飾的二硫化鉬納米片的尺寸為200～300nm，吸附有大量的硫脲，存在豐富的氨基。

所述的硫脲修飾的二硫化鉬納米片優(yōu)選通過如下方法制備得到：將鉬酸鹽和硫源溶解于水中，然后將溶液在微波輻射條件下加熱至220℃進行反應，洗滌、離心、干燥，得到硫脲修飾的二硫化鉬納米片。

所述的硫源和鉬酸鹽按摩爾比為12：1進行配比。

所述的鉬酸鹽優(yōu)選為四水合鉬酸銨((NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O)。

所述的硫源優(yōu)選為硫脲。

所述的反應的時間優(yōu)選為10分鐘。

所述的水優(yōu)選為蒸餾水。

所述的洗滌為用蒸餾水洗滌3次或乙醇洗滌3次，優(yōu)選為用蒸餾水和乙醇各洗滌3次。

所述的離心的條件優(yōu)選為10000r/min離心5min。

所述的干燥的溫度優(yōu)選為50℃，干燥的時間優(yōu)選為24h。

所述的二硫化鉬納米片電化學傳感器的制備方法，包括如下步驟：

(1)將硫脲修飾的二硫化鉬納米片超聲分散在混合溶液A中，得到硫脲修飾的二硫化鉬分散液，其中，混合溶液A由全氟磺酸(Nafion)溶液、PVDF(聚偏氟乙烯)溶液和乙醇溶液組成；

(2)將步驟(1)中得到的硫脲修飾的二硫化鉬分散液凃覆在玻碳電極上，干燥，得到涂覆有硫脲修飾的二硫化鉬分散液的玻碳電極；

(3)將步驟(2)中得到的涂覆有硫脲修飾的二硫化鉬分散液的玻碳電極浸泡在由PBS緩沖液、GE11多肽和EDC·HCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)組成的混合溶液B中，4℃保存，得到二硫化鉬納米片電化學傳感器。

步驟(1)中硫脲修飾的二硫化鉬納米片添加量為按每mL(毫升)混合溶液A配比4mg硫脲修飾的二硫化鉬納米片計算。

步驟(1)中所述混合溶液A中全氟磺酸(Nafion)溶液、PVDF(聚偏氟乙烯)溶液和乙醇溶液按體積比4:3:100配比計算。

步驟(1)中所述的超聲的時間優(yōu)選為30分鐘。

步驟(1)中所述的全氟磺酸(Nafion)溶液優(yōu)選為Sigma-Aldrich公司的Nafion溶液。

所述的Nafion溶液的濃度為質(zhì)量百分比5％。

步驟(1)中所述的PVDF(聚偏氟乙烯)溶液優(yōu)選通過如下方法制備得到：將PVDF溶解于N-甲基吡咯烷酮中，攪拌，得到PVDF溶液。

所述的PVDF優(yōu)選為PVDF固體粉末。

所述的N-甲基吡咯烷酮的添加量為按每g(克)PVDF配比12mL N-甲基吡咯烷酮計算。

所述的攪拌的時間優(yōu)選為12小時。

步驟(1)中所述的乙醇溶液為乙醇水溶液，優(yōu)選為乙醇和水按體積比1:4配比得到的乙醇溶液。

步驟(2)中所述的玻碳電極優(yōu)選為直徑為3mm的玻碳電極。

步驟(2)中所述的涂覆優(yōu)選通過如下方法實現(xiàn)：取硫脲修飾的二硫化鉬分散液，采用滴凃的涂覆方法，均勻地涂覆在潔凈的玻碳電極的表面。

所述潔凈的玻碳電極優(yōu)選通過如下方法制備得到：將玻碳電極依次用2000鉬砂紙、鋁粉打磨，再依次用超純水、硝酸水溶液、乙醇水溶液分別超聲洗滌，自然晾干，得到潔凈的玻碳電極。

所述的硝酸水溶液按硝酸和水的體積比為1:1配比得到。

所述的乙醇水溶液按乙醇和水的體積比為1:1配比得到。

所述的超聲洗滌的時間優(yōu)選為2分鐘。

步驟(2)中所述的干燥優(yōu)選為在室溫條件下自然干燥。

步驟(3)中所述的保存的時間優(yōu)選為2.5小時。

所述的二硫化鉬納米片電化學傳感器在生物醫(yī)學領域中的應用。

所述的二硫化鉬納米片電化學傳感器在細胞檢測中的應用。

所述的細胞優(yōu)選為HepG2肝癌細胞。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果：

1、本發(fā)明方法制備的硫脲修飾的二硫化鉬納米片具有規(guī)則的二維片狀結(jié)構和大比表面，存在豐富的氨基有利于與生物分子結(jié)合，因此這種硫脲修飾的二硫化鉬納米片在生物傳感器領域中應用。

2、本發(fā)明方法制備條件簡單易控，工藝條件成本低，制備效率高，產(chǎn)品質(zhì)量以及成品率高，有良好的應用和產(chǎn)業(yè)化前景。對該方法系統(tǒng)的研究，不僅可以提供新穎的電化學生物傳感器材料，而且對材料的合成方法學以及臨床應用具有廣泛的意義。

3、本發(fā)明制得的硫脲修飾的二硫化鉬納米片比表面高，活性位點多，且保持良好的納米片的形貌，利于針對實際的需要進行表面改性和組裝，具有開發(fā)潛力和應用前景。

4、本發(fā)明制得的多肽-硫脲修飾的二硫化鉬納米片構建的電化學傳感器，修飾方法簡單，對被檢測目標分子不會造成損壞。

5、本發(fā)明制得的多肽-硫脲修飾的二硫化鉬納米片構建的電化學傳感器，可實現(xiàn)對HepG2肝癌細胞的檢測，并具有響應時間快、線性范圍寬、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高的優(yōu)點，對HepG2肝癌細胞的檢測線性范圍為50～1.0×10⁶cells mL^-1，檢測限為50cells mL^-1。

6、本發(fā)明將微波法合成的硫脲修飾的二硫化鉬納米片涂覆在玻碳電極表面，再浸泡在GE11多肽溶液中，連接GE11多肽，既得所需傳感器。所述多肽-硫脲修飾的二硫化鉬納米片構建的電化學傳感器可實現(xiàn)對HepG2肝癌細胞的檢測(GE11多肽可以與HepG2細胞特異性識別)，表現(xiàn)出很好的電催化活性，并具有響應時間快、線性范圍寬、檢測限低、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高等特點。

7、本發(fā)明是針對生物傳感器的現(xiàn)有技術缺陷進行改進，主要特點表現(xiàn)在：(1)傳感材料的合成，本發(fā)明中有硫脲修飾的二硫化鉬納米片作為傳感材料，以微波法一步合成，方法高效簡便，并且在材料修飾過程中不破壞材料本身的形貌結(jié)構，同時提高生物相容性，較現(xiàn)有技術更簡便；(2)傳感器的構建，本發(fā)明以GE11多肽-硫脲修飾的二硫化鉬納米片為傳感器，構建方法只需浸泡(硫脲存在豐富的氨基可與多肽相連)，較現(xiàn)有技術更為便捷；(3)檢測方法，本發(fā)明采用的電化學方法相比于傳統(tǒng)方法更高效簡便，靈敏度更高。

附圖說明

圖1為二硫化鉬納米片電化學傳感器結(jié)構示意圖，其中，1為硫脲修飾的二硫化鉬納米片，2為玻碳電極基底，3為絕緣層，4為電極引線。

圖2為硫脲修飾的二硫化鉬納米片的合成路線和電化學傳感器構建的示意圖，其中，圖a是合成路線圖，圖b是電化學傳感器構建的示意圖。

圖3是實施例1制得的硫脲修飾的二硫化鉬(產(chǎn)物A)的掃描電鏡(SEM)圖。

圖4是實施例1制得的產(chǎn)物A的透射電鏡(TEM)圖。

圖5是實施例1制得的產(chǎn)物A的高分辨透射電鏡(HRTEM)圖。

圖6是實施例1制得的產(chǎn)物A的X射線粉末衍射(XRD)圖。

圖7是實施例1制得的產(chǎn)物A的紅外光譜(IR)圖。

圖8是實施例1制得的產(chǎn)物A的熱重分析(TGA)圖。

圖9是實施例2中的多肽-硫脲修飾的二硫化鉬電化學傳感器用于檢測HepG2肝癌細胞的交流阻抗譜(EIS)圖。

圖10是實施例2中的多肽-硫脲修飾的二硫化鉬電化學傳感器用于檢測HepG2肝癌細胞所得交流阻抗值(ΔR_ct)與HepG2細胞濃度的對數(shù)值(logC_cell)線性關系圖。

圖11是實施例1制得的產(chǎn)物B的掃描電鏡(SEM)圖。

圖12是實施例1制得的產(chǎn)物B的高分辨透射電鏡(HRTEM)圖。

圖13是實施例1制得的產(chǎn)物B的X射線粉末衍射(XRD)圖。

圖14是實施例2中的多肽-二硫化鉬電化學傳感器用于檢測HepG2肝癌細胞的交流阻抗譜(EIS)圖。

圖15為實施例2中的多肽-二硫化鉬電化學傳感器用于檢測HepG2肝癌細胞所得交流阻抗值(ΔRct)與HepG2細胞濃度的對數(shù)值(logCcell)線性關系圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

本發(fā)明實施例中所用的試劑均可購買得到。

本發(fā)明實施例所用到的設備：上海屹堯微波消解儀(WX-8000)、CHI650E電化學工作站、ZEISS ULTRA55型場發(fā)射掃描電鏡、JEOL JEM 2100F型透射電鏡、Bruker D8型X射線衍射儀。

實施例1

1、按照以下步驟制備硫脲修飾的二硫化鉬納米片：

(1)將0.35g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O和1.83g硫脲溶解于15mL蒸餾水中，然后將溶液轉(zhuǎn)移至微波反應釜中，在微波輻射條件下加熱至220℃，反應10分鐘，得到黑色固體，為產(chǎn)物A(硫脲修飾的二硫化鉬納米片)；將得到的產(chǎn)物A用蒸餾水、乙醇各洗滌3次，10000r/min離心5min，50℃干燥24h。

(2)將步驟(1)干燥后的產(chǎn)物A加入15mL 0.05mol/L的H₂SO₄，在微波輻射條件下加熱至150℃，反應2小時，得到的產(chǎn)物B(去除硫脲的二硫化鉬納米片)用蒸餾水洗滌數(shù)次，50℃干燥24h，用于與步驟(1)制備的有硫脲修飾的二硫化鉬納米片做對比實驗。

2、多肽-硫脲修飾的二硫化鉬納米片電化學細胞傳感器的制備方法：

(1)將4mg上述方法獲得的硫脲修飾的二硫化鉬納米片(產(chǎn)物A)超聲(超聲的時間為30分鐘以上)分散在40μL Nafion(全氟磺酸)溶液、30μL PVDF(聚偏氟乙烯)溶液和1mL乙醇水溶液(乙醇和水的體積比為1:4)混合溶液中，得到均勻的黑色的硫脲修飾的二硫化鉬分散液；將5μL的硫脲修飾的二硫化鉬分散液，采用滴凃的涂覆方法，均勻地涂覆在潔凈的玻碳電極(直徑為3mm)表面。在室溫下自然干燥；其中，潔凈的玻碳電極的制備方法為：將玻碳電極依次用2000鉬砂紙、鋁粉打磨，再依次用超純水、硝酸水溶液(體積比為1:1)、乙醇水溶液(體積比為1:1)分別超聲洗滌2分鐘，自然晾干；混合溶液中：

Nafion溶液：購于Sigma-Aldrich公司(為5wt％分散在脂肪醇與水的混合溶液中，其中，水：15％～20％(v/v))；

PVDF溶液：以0.5g PVDF(分子量530000，購于Sigma-Aldrich)固體粉末溶解于6mL N-甲基吡咯烷酮中，攪拌12小時所得，現(xiàn)配現(xiàn)用。

(2)將上述玻碳電極浸泡在以0.5mL PBS緩沖液(濃度為0.01M，pH 7.4)與1.0mg GE11多肽(購于GL Biochem Ltd.(Shanghai))和0.1mM EDC·HCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，購于Sigma-Aldrich)的混合溶液中，在4℃條件下保存2.5小時，即得所需傳感器(硫脲修飾的二硫化鉬納米片電化學細胞傳感器)。

實施例2

1、實施例1的產(chǎn)品(產(chǎn)物A和產(chǎn)物B)的掃描電鏡照片(SEM)均在ZEISS ULTRA55儀器上攝取，透鏡照片(TEM)在JEOL JEM 2100F儀器上攝取。

圖3和圖11分別為實施例1中制備得到的硫脲修飾的二硫化鉬納米片(產(chǎn)物A)和酸處理后去除硫脲的二硫化鉬納米片(產(chǎn)物B)的掃描電鏡照片，可以看出產(chǎn)物A、B均呈200～300nm薄納米片狀，說明硫脲的吸附并不會改變材料本身的形貌。透鏡照片(圖4)觀察到納米片在吸附了過量硫脲后呈現(xiàn)松散的狀態(tài)，同時高分辨透射電鏡照片(圖5和圖12)觀察到在吸附過量硫脲后，(002)晶面較酸處理除去硫脲后晶面間距要大，但活性晶面(010)和(100)的晶面間距不發(fā)生改變，(002)晶面較六方晶系的二硫化鉬晶面間距要大，證明過量硫脲吸附?jīng)]有破壞活性晶面并且吸附硫脲后獲得豐富的氨基。用XRD(在Bruker D8型X射線衍射儀上進行)對所得產(chǎn)物A和產(chǎn)物B進行表征，結(jié)果見圖6和圖13，圖6和圖13證明了產(chǎn)物為六方晶系的MoS₂(JCPDS：37-1492)，同時(002)晶面衍射峰移動至9.64°，證明成功吸附硫脲，使得層間距增大。

圖7和圖8分別為產(chǎn)物A的紅外光譜圖與熱重分析圖。由7可見，實施例1合成的硫脲修飾的二硫化鉬納米片(產(chǎn)物A)與酸處理去除過量硫脲的二硫化鉬納米片(產(chǎn)物B)相比，有明顯的v_N-H(3140cm^-1)，v_C＝S(1400cm^-1)，v_C-N(1108cm^-1)和δ_N-H(619cm^-1)吸收峰，說明實施例1制備的產(chǎn)物A吸附大量硫脲，存在豐富的氨基。熱重分析圖(圖8)可知，有硫脲修飾的二硫化鉬納米片(產(chǎn)物A)在280～350℃溫度范圍有明顯的失重現(xiàn)象，與純硫脲的失重溫度范圍(175～245℃)相比有明顯的滯后，說明硫脲與二硫化鉬之間有強的相互作用。

2、將實施例1中制得的硫脲修飾的二硫化鉬電化學傳感器用于檢測HepG2肝癌細胞。其中，本發(fā)明所用人體肝癌HepG2細胞來源于中國上海細胞資源中心生命科學研究所。細胞培養(yǎng)方法：細胞置于24孔玻璃培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中包括10％(v/v)胎牛血清、100μg mL^-1青霉素和100μg mL^-1鏈霉素，并將培養(yǎng)基置于37℃，5％CO₂恒溫箱中保存。測定條件：測定介質(zhì)為0.01M磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)、10mM[Fe(CN)₆]^3-/4-和0.5M KCl的混合溶液；采用交流阻抗法(EIS)，其測定參數(shù)為：工作電壓為開路電壓，頻率范圍：10^-1～10⁵Hz，振幅：5mV。

圖9是將本發(fā)明多肽-硫脲修飾的二硫化鉬電化學傳感器用于檢測HepG2肝癌細胞的交流阻抗譜圖，其中，HepG2肝癌細胞的細胞濃度分別為50cells/ml、100cells/ml、200cells/ml、10³cells/ml、10⁴cells/ml、10⁵cells/ml和10⁶cells/ml。由圖9中可見，隨著HepG2細胞濃度的增加，阻抗值隨之增加，說明本發(fā)明所構建的多肽-硫脲修飾的二硫化鉬電化學傳感器可成功捕獲HepG2肝癌細胞，并用電化學方法對其進行檢測。

圖10為多肽-硫脲修飾的二硫化鉬電化學傳感器用于檢測HepG2肝癌細胞所得交流阻抗值(ΔR_ct)與HepG2細胞濃度的對數(shù)值(logC_cell)線性關系圖，從圖10中可知，在HepG2細胞濃度范圍為50～10⁶cells mL^-1中ΔR_ct與logC_cell呈良好的線性關系，確定系數(shù)(R²)為0.991，檢測限達50cells mL^-1。

圖14為酸處理除去硫脲后的二硫化鉬納米片所構建的傳感器(傳感器的構建方法參考實施例1中多肽-硫脲修飾的二硫化鉬納米片電化學細胞傳感器的制備方法)，用于檢測HepG2肝癌細胞所得交流阻抗圖。由圖可知，隨著HepG2細胞濃度的增加，阻抗值并未按一定規(guī)律隨之變化，圖15中的內(nèi)插圖也表明交流阻抗值(ΔR_ct)與HepG2細胞濃度的對數(shù)值(logC_cell)不呈線性關系，說明酸處理除去硫脲后，二硫化鉬納米片缺乏氨基等基團，致使無法與GE11多肽連接，從而無法捕獲HepG2細胞。

由于該類二硫化鉬納米片在合成過程中在微波輻射的輔助下使得過量的硫脲更易吸附在活性位上，使二硫化鉬上吸附硫脲，獲得豐富的氨基等基團，再通過簡單浸泡的方法與GE11多肽連接，最終得到多肽-硫脲吸附的二硫化鉬電化學生物傳感器，并用于HepG2肝癌細胞的檢測。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。