一種制備侵染生姜的黃瓜花葉病毒抗血清的制備方法，屬免疫技術領域。
背景技術：
黃瓜花病毒(CMV)是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucurnovirus)的典型成員，具有典型的三分體正義單鏈RNA (ssRNA)病毒的特點。CMV的寄主范圍十分廣泛，它能侵染包括茄科、十字花科、豆科等1000多種植物，對經(jīng)濟作物產(chǎn)生嚴重危害。CMV侵染生姜后出現(xiàn)花葉、矮化或者褪綠，且這些癥狀往往是復合出現(xiàn)。CMV因其發(fā)生的普遍性和所引起病害的嚴重性，是目前研究最多的植物RNA病毒之一。
生姜(Zingiber offcinale Rosc．)為姜科姜屬多年生宿根草本植物，侵染生姜并引起嚴重危害的病毒主要是黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus, CMV) 和煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)。由于生姜采用無性繁殖，病毒逐年積累，病毒危害也逐年加重，病毒病可導致生姜減產(chǎn)30-50%，且影響品質(zhì)。目前沒有防治病毒病的有效藥物，解決病毒病的途徑是通過篩選無病毒生姜進行繁育，建立種子基地，用無病毒良種栽培。
雖然檢測植物病毒的方法有多種，但間接ELISA法是最常用的方法，每次可以檢測幾十乃至上百個樣品，是一種經(jīng)濟、實用的方法，成本也低。由于市場上沒有能檢測侵染生姜的黃瓜花葉病毒的抗血清，脫毒生姜種苗的質(zhì)量多通過目測或者指示植物方法確定是否脫毒完全，既缺乏科學性又費時。本發(fā)明制備檢測侵染生姜的黃瓜花葉病毒抗血清，可大大方便該病毒的檢測。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明用感染黃瓜花葉病毒的生姜葉片為材料，首先粗提取病毒顆粒，然后通過5-20%梯度SDS-PAGE分離其外殼蛋白，切下乳白色外殼蛋白（CP）條帶，將含CP的凝膠磨細后免疫注射小鼠，獲得高效價的抗黃瓜花葉病毒血清。
本發(fā)明的具體技術方案如下：
一種制備侵染生姜的黃瓜花葉病毒抗血清的方法，其特征在于，包括以下步驟：
a、粗病毒的提取將黃瓜花葉病毒侵染的生姜病葉勻漿，過濾和低速離心去除大的固體雜質(zhì)，四氯化碳去除葉綠素，加入聚乙二醇6000（PEG6000）、NaCl和Triton-X 100后靜置使病毒粒子沉淀，用20%蔗糖墊進一步純化獲得的黃瓜花葉病毒顆粒， 將其溶解于PBS中，得到病毒懸液，于-80°C儲存?zhèn)溆茫?/p>
b、黃瓜花葉病毒外殼蛋白的5-20% SDS-PAGE梯度分離純化將病毒懸液與等體積的1.5-2.5倍SDS上樣緩沖液混合，沸水浴加熱8-12分鐘，冷卻后離心除去沉淀，然后將樣品加入制備型的5-20% SDS-PAGE梯度凝膠板中電泳，完畢后凝膠用4°C的0.25M KCl浸泡染色，切下乳白色的黃瓜花葉病毒外殼蛋白條帶，平分3-5份；
c、將含外殼蛋白的凝膠加生理鹽水磨細后，免疫注射3-5只小鼠，4次免疫注射，兩次之間間隔6-7天，第一次注射方式為皮下注射0.24-0.26 mL,腹腔注射0.24-0.26 mL，第二、第三和第四次注射均腹腔注射0.48-0.52 mL，第四次注射后第3天斷頭取血，6小時后離心獲得抗血清。
所述的抗血清制備方法制得的抗血清。
所述的抗血清在侵染生姜黃瓜花葉病毒檢測上的應用。
本發(fā)明技術效果體現(xiàn)在幾個方面：
1、制備的抗血清特異性強
由于采用梯度制備電泳的方法純化黃瓜花葉病毒的外殼蛋白（CP），純化的CP特別純，不含其他蛋白，因此制備的抗血清只與黃瓜花病毒CP作用，特異性很強；
2、不使用昂貴的福氏佐劑，降低抗血清的生產(chǎn)成本
本發(fā)明將外殼蛋白（CP）包埋在網(wǎng)狀的聚丙烯酰胺凝膠中，外殼蛋白（CP）從網(wǎng)狀的聚丙烯酰胺凝膠中緩慢釋放到動物體內(nèi)，抗原在動物體內(nèi)停留時間長，充分刺激免疫系統(tǒng)，用聚丙烯酰胺凝膠替代了昂貴的福氏佐劑。
具體實施方式
實施例一：
第一步：粗病毒的提取
（1）取100 g黃瓜花葉病毒侵染的生姜病葉勻漿，加入400 mL的Buffer A (0.5 mol/L 磷酸鉀緩沖液，含0.1 % 2-巰基乙醇，0.01 mol/L EDTA，pH 7.0)，用4層紗布過濾，經(jīng)低速離心（5,000 g）15 分鐘去除固體雜質(zhì)；
（2）將上清液加1/4體積的四氯化碳（CCl4）劇烈攪拌5 分鐘，低速離心（5,000 g）20 分鐘去除沉淀的葉綠素；
3、將上清加入聚乙二醇6000（PEG6000）、NaCl和Triton-X 100，分別至終濃度6%（W/V）、3%（W/V）和1%（V/V），攪拌30 分鐘使PEG6000完全溶解，4°C靜置6 h使病毒粒子沉淀完全；
4、棄上清，沉淀部分離心(8,000 rpm) 30 分鐘，棄上清：將沉淀重新懸浮于15-20 mL Buffer B (0.5 mol/L尿素的Buffer A)，低速離心（8,000 g ）20 分鐘，將上清轉至84 mL超速離心管中，沉淀重新懸浮于15-20 mL Buffer B，按相同的步驟重復2次，合并上清液于超速離心管中；
5、在超速離心管底部鋪上20%蔗糖墊Buffer C（即Buffer A 100 mL，蔗糖 40 g，加去離子水到200 mL），23,000 g 超速離心1.5 小時，棄上清，沉淀即是黃瓜花葉病毒顆粒，用2.0-3.0 mL PBS溶解，于-80°C儲存?zhèn)溆茫?/p>
第二步：黃瓜花葉病毒外殼蛋白（CP）的分離純化
（1）配制5-20% SDS-PAGE梯度凝膠
（2）取0.5 mL粗病毒液加0.5 mL 2倍SDS上樣緩沖液混合，沸水浴加熱10分鐘，冷卻后離心除去沉淀；
（3）將樣品加入5-20% SDS-PAGE梯度制備凝膠板中，常規(guī)電泳，電泳完畢后用預冷(4°C)的0.25M KCl浸泡染色30 分鐘，取出凝膠，用手術刀切下乳白色的黃瓜花葉病毒外殼蛋白，平均分成4份，冷凍保存；
第三步：注射免疫小鼠，獲得抗血清
取1份上述膠體，加2.0 mL生理鹽水，于研缽內(nèi)充分磨細，吸入到5mL規(guī)格的一次性注射器中，總體積約2.0mL，免疫注射4只小鼠，共注射4次，二次之間間隔7天，第一次注射方式為皮下注射0.25mL,腹腔注射0.25mL，第二、第三和第四次注射均腹腔注射0.5mL，第四次注射后第3天斷頭取血，6小時后離心獲得抗血清，冷凍保存。
第四步：抗血清效價的測定
抗血清效價的測定與ELISA方法相似。
將粗病毒液用包被液（0.1mol/L pH 9.5的碳酸鹽緩沖液）稀釋10倍作為抗原樣品，將獲得的抗血清進行倍比稀釋，以不含病毒的包被液代替抗原樣品為空白，以正常小鼠血清（未免疫的小鼠血清）替代待測抗血清作為陰性對照，用制備的抗血清作為一抗，羊抗小鼠IgG-堿性磷酸酶為二抗，1 mg/mL的p-NPP為底物，顯色45分鐘后在酶標儀上測定OD405值，以空白對照調(diào)零，待測抗血清的吸光值2倍于陰性對照吸光值的效價定為1，抗血清的稀釋倍數(shù)即為抗血清的效價。
（1）抗原包被：酶標板每孔加100μL包被抗原，酶標板置4oC冰箱過夜。
（2）封閉：加封閉液，每孔120 μL ，37 oC孵育1 小時。
（3）加一抗：加入倍比稀釋的抗血清（ELISA緩沖液稀釋），陰性為未免疫的小鼠血清，37 oC孵育1 h。
（4）加酶標二抗：加入1/10000的羊抗小鼠IgG-堿性磷酸酶（Sigma，ELISA緩沖液稀釋），37 oC孵育1 小時。
（5）加底物：1 mg/mL的p-NPP（Sigma，溶于底物緩沖液，pH 9.8），37 oC黑暗中孵育45分鐘，測OD405值。
注：每一步完成后均用PBST洗3次，每次5分鐘以上。
經(jīng)過計算，實施例一制備的抗血清效價達到480。
實施例二：
第一步：粗病毒的提取
與“實施例一”第一步相同。
第二步：黃瓜花葉病毒CP的分離純化
本步驟用的粗病毒液比“實施例一”少，除了取0.4 mL粗病毒液加0.4 mL 2倍SDS上樣緩沖液混合外，其他與“實施例一”第二步相同。
第三步：注射免疫小鼠，獲得抗血清
與“實施例一”第三步相同。
第四步：抗血清效價的測定
檢測過程與“實施例一”第四步相同。
經(jīng)過計算，實施例二制備的抗血清效價達到473。
實施例三：
第一步：粗病毒的提取
與“實施例一”第一步相同。
第二步：黃瓜花葉病毒CP的分離純化
本步驟用的粗病毒液比“實施例一”多，除了取0.6 mL粗病毒液加0.6 mL 2倍SDS上樣緩沖液混合外，其他與“實施例一”第二步相同。
第三步：注射免疫小鼠，獲得抗血清
與“實施例一”第三步相同。
第四步：抗血清效價的測定
檢測過程與“實施例一”第四步相同。
經(jīng)過計算，實施例一制備的抗血清效價達到478。
本發(fā)明用不同劑量的黃瓜花葉病毒顆粒，采用5-20% SDS-PAGE梯度凝膠電泳分離外殼蛋白，外殼蛋白連同聚丙烯酰胺凝膠免疫小鼠，均獲得高效價抗血清，說明該技術實用、可靠。