本發(fā)明涉及體外診斷領(lǐng)域,尤其涉及一種人髓過氧化物酶活性及總量檢測試劑盒和相應(yīng)的人髓過氧化物酶活性及總量檢測方法、制備方法。
背景技術(shù):
:人髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)又稱過氧化物酶,是一種重要的含鐵溶酶體,存在于髓系細胞(主要是中性粒細胞和單核細胞)的嗜苯胺藍顆粒中,是髓細胞的特異性標(biāo)志,是人體免疫系統(tǒng)的一個重要組成部分。在某些炎癥發(fā)生的時候,MPO被激活的中性粒細胞和單核細胞釋放,可以將過氧化氫和氯離子轉(zhuǎn)化為一種可以殺滅微生物的強氧化劑次氯酸(HClO),以殺滅病原物。國內(nèi)外的醫(yī)學(xué)研究表明,血液中MPO濃度的升高與不穩(wěn)定型的動脈粥樣斑塊的形成密切相關(guān)。在因胸痛而就醫(yī)的病人中,血液中MPO濃度的升高表明心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險增大。當(dāng)血液中MPO的濃度高于2990pM時,60%的病人在未來一個月內(nèi)發(fā)生了重大心臟不良事件(心梗、猝死、或緊急進行冠狀動脈搭橋/支架安放手術(shù))。由于血液中MPO水平的升高在心血管疾病發(fā)生之前就可以檢測到,使MPO可以作為心血管疾病的預(yù)警指標(biāo),其預(yù)警的靈敏度和準(zhǔn)確性要大大優(yōu)于其他指標(biāo)如超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)和心肌肌鈣蛋白T(cTnT)。冠心病是心血管系統(tǒng)中最常見的疾病,而動脈粥樣硬化(AS)又是形成冠心病的重要病理基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn),MPO缺陷的個體罹患心血管疾病的危險性明顯下降。MPO水平的升高不僅與患冠狀動脈疾病易感性相關(guān),還可以預(yù)測早期患心肌梗死的危險性。MPO水平已被公認為有助于評定急性ST段抬高的心肌梗塞患者的預(yù)后。MPO水平對于急性冠脈綜合征(ACS)危險性評估及初步診斷,是一個很好的指標(biāo),MPO的檢測意味著在更早的階段發(fā)現(xiàn)并及時干預(yù)冠心病,可以作為新的預(yù)測心血管事件發(fā)生的標(biāo)志物,尤其是針對不穩(wěn)定型冠心病。因此開發(fā)出一種新的用于心腦血管疾病超前預(yù)測的檢測試劑盒,能夠提前預(yù)測患者病情,及時治療,降低患病風(fēng)險和患者死亡風(fēng)險,減輕社會負擔(dān)、減輕病人的痛苦,簡化了治療的流程,降低醫(yī)生的工作強度,同時也能大大降低國家、醫(yī)院以及患者個人的治療費用支出,減輕社會負擔(dān),具有重要的、積極的社會意義。在現(xiàn)有技術(shù)中,用酶聯(lián)免疫法測定血液中MPO的含量,間接表明血液中MPO酶活性。這種方案的缺點是有時MPO含量與MPO活性并不相關(guān),如MPO基因變異人群及血液中有MPO抑制物的人群等;直接測定血液MPO酶活性方法是直接加MPO酶底物到樣本中,其中MPO分解合成反應(yīng)底物,生成顏色反應(yīng)產(chǎn)物,再測算出MPO酶活性。這種方案的缺點是測定樣本中除了髓過氧化物酶以外,一般還有其他的過氧化物酶存在,對酶活性檢測的結(jié)果有很大程度的干擾,大大地降低了樣本中MPO酶活性的特異性。技術(shù)實現(xiàn)要素:基于此,有必要提供一種新的人髓過氧化物酶檢測方式,來解決MPO含量與MPO活性并不相關(guān)的問題,并去除樣本中其他雜質(zhì)的干擾,大大提高特異性和準(zhǔn)確率、縮短測量時間、降低了試劑盒成本,且方便操作。根據(jù)本發(fā)明的第一方面,本發(fā)明公開一種人髓過氧化物酶活性及總量檢測試劑盒,包括有固相載體、酶分解底物、緩沖液、酶標(biāo)抗體試劑、校準(zhǔn)品、洗滌液、顯色底物和終止液,其中:所述固相載體包被有200~400ng/孔的抗-MPO非抑制性抗體;所述酶分解底物包括有0.1-50mmol/L的H2O2;所述酶標(biāo)抗體試劑含有使用量為1:2000~1:8000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗-MPO抑制性抗體;所述校準(zhǔn)品包括有MPO抗原含量為0-1000ng/ml的多個校準(zhǔn)品;所述顯色底物至少包括含有0.015-0.02%的過氧化物的顯色底物A液和含有0.25-0.32g/L的TMB顯色底物B液。根據(jù)本發(fā)明的第二方面,本發(fā)明公開一種人髓過氧化物酶活性及總量檢測方法,包括:在酶標(biāo)板的每孔中加入100ul抗-MPO非抑制性抗體(5ug/ml)和50mM碳酸鹽緩沖液,調(diào)節(jié)pH值為9.6,在4℃條件下靜止8-12小時后,去除緩沖液;在酶標(biāo)板的每孔中加入200μl封閉液,在4℃條件下封閉2小時后,去除封閉液;在酶標(biāo)板的每孔中加入80ul樣品稀釋液和20ul血清或血漿樣品,在室溫下反應(yīng)30分鐘后,去除稀釋液;加入200ul緩沖液和50ul酶分解底物,混合反應(yīng)2分鐘后,測定OD值;繪制酶活性-OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線,算得待測樣品中MPO酶活性;測定OD值后立即去除酶標(biāo)板中的反應(yīng)液,洗滌封閉;加入酶標(biāo)抗體試劑100μl,置37℃繼續(xù)溫育30分鐘;在酶標(biāo)板的每孔中加入顯色底物A液和顯色底物B液各50μl混勻,37℃避光顯色15分鐘后,每孔加終止液50μl,混勻后10分鐘內(nèi),測定校準(zhǔn)品和待檢樣品的OD值;以校準(zhǔn)品抗原濃度為橫坐標(biāo)、校準(zhǔn)品相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并將待測樣品OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,算得待測樣品中MPO濃度。根據(jù)本發(fā)明的第二方面,本發(fā)明公開一種人髓過氧化物酶活性及總量檢測試劑盒的制備方法,包括:在包被液中按照包被量為200~400ng/孔加入抗-MPO非抑制性抗體,充分混勻后進行包被,包被完成后將酶標(biāo)板置于2-8℃環(huán)境放置14~16個小時后取出,洗板機各洗板1次,拍干后,200μl/孔加入1中配制好封閉液,37℃溫箱放置150±15分鐘后取出,甩干并拍干,并干燥24-26個小時;按照使用量1:2000~1:8000在酶標(biāo)抗體稀釋液中加入HRP標(biāo)記抗體,充分混勻;分別配置如上所述的校準(zhǔn)品、洗滌液、顯色底物和終止液。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的實施例通過采用酶法和ELISA共同檢測的方法來測定樣品中MPO的活性及總量,從而達到了在一個樣本的一次檢測過程中同時檢測酶的活性和酶的總量,活性和總量結(jié)果的對比既能預(yù)防有時MPO含量與MPO活性并不相關(guān)的概率,又去除了樣本中其他物質(zhì)的干擾,大大提高了特異性和準(zhǔn)確率、縮短了測量時間、降低了試劑盒成本,且操作方便的效果。并可為酶活抑制劑的研發(fā)提供依據(jù),酶總量及酶活性結(jié)果同時檢測更準(zhǔn)確地反應(yīng)了MPO在體內(nèi)的情況,為臨床診斷和預(yù)警動脈粥樣硬化冠心病提供了更準(zhǔn)確的依據(jù)。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案,下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹,顯而易見地,下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例,對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講,在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下,還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1是本發(fā)明的人髓過氧化物酶活性及總量檢測方法一個實施例中MPO的含量曲線示意圖。具體實施方式下面詳細描述本發(fā)明提供的人髓過氧化物酶活性及總量檢測試劑盒的一個實施例;本實施例主要包括:固相載體、酶分解底物、緩沖液、酶標(biāo)抗體試劑、校準(zhǔn)品、洗滌液、顯色底物和終止液,其中:所述固相載體包被有200~400ng/孔的抗-MPO非抑制性抗體;所述酶分解底物包括有0.1-50mmol/L的H2O2;所述酶標(biāo)抗體試劑含有使用量為1:2000~1:8000的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗-MPO抑制性抗體;所述校準(zhǔn)品包括有MPO抗原含量為0-1000ng/ml的多個校準(zhǔn)品;所述顯色底物至少包括含有0.015-0.02%的過氧化物的顯色底物A液和含有0.25-0.32g/L的TMB顯色底物B液;所述終止液含有濃度不高于2mol/L的硫酸。濃縮洗滌液(20×):0.01MPBS,含不低于1.5%的表面活性劑;在一個具體的實施方式中,所述固相載體可采用含有以下組分的包被液包被所述抗-MPO抗體:Na2CO3:10.-2.1g/L;NaHCO3:2.5-3.5g/L;在一個具體的實施方式中,所述緩沖液包括以下組分:檸檬酸:6.0-10.0g/L;檸檬酸鈉:10.0-15.0g/L;苯酚:0.5-1.5g/L;BSA:0.1-2.0g/L;在一個具體的實施方式中,所述酶分解底物溶液可包括有以下組分:H2O2:0.2-10.0ml/L;4-氨基安替吡啉(sigma):1.0-10.0g/L;BSA:0.1-5.0g/L。在一個具體的實施方式中,所述固相載體可采用含有以下組分的封閉液封閉所述抗-MPO非抑制性抗體:BSA:1.0-10.0g/L;蔗糖:40.0-60.0g/L;酪蛋白:1.0-10.0g/L;明膠:1.0-10.0ml/L;50mMTB8.0:40.0-60.0ml/L;TritonX-100:1.0-300ml/L;Proclin300:0.5-2.0ml/L。在一個具體的實施方式中,所述酶標(biāo)抗體試劑可采用含有以下組分的稀釋液:BSA:1.0-20.0g/L;蔗糖:20.0-80.0g/L;酪蛋白:1.0-10.0g/L;NBS:80.0-120.0ml/L;明膠:1.0-10.0ml/L;50mMTB8.0:40.0-60.0ml/L;Proclin300:0.5-1.5ml/L。在一個具體的實施方式中,所述校準(zhǔn)品可包括有人源MPO抗原含量分別為1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml、50ng/ml和0ng/ml的至少一種校準(zhǔn)品;且所述校準(zhǔn)品采用含有以下組分的校準(zhǔn)品稀釋液:Na2HPO4·12H2O:40.0-65.0g/L;NaH2PO4·2H2O:5.0-10.0g/L;NBS:150.0-250.0ml/L;甘油:25.0-80.0ml/L;Tween-20:0.1-2.0ml/L;Proclin300:0.1-2.0ml/L。在一個具體的實施方式中,所述顯色底物A液可包括以下組分:三水合乙酸鈉:20.0-40.0g/L;檸檬酸:2.0-5.0g/L;30%H2O2:0.5-0.8ml/L;所述顯色底物B液可包括以下組分:乙二胺四乙酸二鈉:0.1-0.8g/L;檸檬酸:1.0-3.0g/L;甘油:50.0-150.0ml/L;TMB:0.1-0.5g/L;DMSO:1.0-10.0ml。在一個具體的實施方式中,所述濃縮洗滌液(20×)可包括以下組分:Na2HPO4·12H2O:50.0-100.0g/L;KH2PO4:2.0-8.0g/L;NaCl:100.0-200.0g/L;KCl:2.0-6.0g/L;Tween-20:10.0-30.0ml/L。在一個具體的實施方式中,所述固相載體可以采用酶標(biāo)板或平底試管,或者其它用于包被的固相載體等。下面參考圖1詳細描述采用本發(fā)明的試劑盒檢測人血清或血漿中MPO的活性及含量的方法的一個實施例。含有EDTA、檸檬酸鈉或肝素等抗凝劑的樣品可用本試劑盒檢測。在酶標(biāo)板的每孔中加入100ul抗-MPO非抑制性抗體(5ug/ml)和50mM碳酸鹽緩沖液,調(diào)節(jié)pH值為9.6,在4℃條件下靜止8-12小時后,去除緩沖液;在酶標(biāo)板的每孔中加入200μl封閉液,在4℃條件下封閉2小時后,去除封閉液;在酶標(biāo)板的每孔中加入80ul樣品稀釋液和20ul血清或血漿樣品,在室溫下反應(yīng)30分鐘后,去除稀釋液;加入200ul緩沖液和50ul酶分解底物,混合反應(yīng)2分鐘后,測定OD值;繪制酶活性-OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線,算得待測樣品中MPO酶活性;測定OD值后立即去除酶標(biāo)板中的反應(yīng)液,洗滌封閉。加入酶標(biāo)抗體試劑100μl,置37℃繼續(xù)溫育30分鐘;在酶標(biāo)板的每孔中加入顯色底物A液和顯色底物B液各50μl混勻,37℃避光顯色15分鐘后,每孔加終止液50μl,混勻后10分鐘內(nèi),測定校準(zhǔn)品和待檢樣品的OD值;以校準(zhǔn)品抗原濃度為橫坐標(biāo)、校準(zhǔn)品相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并將待測樣品OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,算得待測樣品中MPO濃度。檢測方法實例1抗MPO非抑制性抗體(10ug/ml)與50mM(pH9.6)的碳酸鹽緩沖液充分混勻,加100ul到酶標(biāo)板每孔中,4℃,過夜;用洗滌液洗滌一次,每孔加200μl封閉液,4℃封閉2小時;甩干封閉液,洗滌一次;加80ul樣品稀釋液和20ul血清或血漿樣品到孔中混合液,在室溫下,反應(yīng)30分鐘;甩掉液體,用洗滌液洗滌二次;加200ul緩沖液(檸檬酸鈉緩沖液,10mmol/L苯酚),再加50ul酶分解底物(H2O220mmol/L),混合,室溫放置,分別于1.5min、2min、3min用波長505nm,測定OD值;MPO酶活性檢驗結(jié)果計算:以校準(zhǔn)品(0、50、100、250、500、1000ng/ml)抗原濃度為橫坐標(biāo)、校準(zhǔn)品相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo),可以采用四參數(shù)(4PL)或點對點的擬合方式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并將待測樣品OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,算得待測樣品中MPO活性;測定OD值后立即去除酶標(biāo)板中的反應(yīng)液,用洗滌液洗滌2次,封閉液封閉后再洗2次;加入酶標(biāo)抗體試劑100μl,置37℃繼續(xù)溫育30分鐘;用洗滌液洗滌3次;顯色:每孔加入顯色底物A液和顯色底物B液各50μl,輕輕振蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘。顯色底物A液和顯色底物B液可以按需求等量混合,然后每孔加入100μl底物混合液;終止測定:每孔加終止液50μl,輕輕振蕩混勻,10分鐘內(nèi)測定結(jié)果(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色),空白孔調(diào)零,450nm波長測量各孔吸光度(OD值);MPO酶總量檢驗結(jié)果計算:以校準(zhǔn)品(0、50、100、250、500、1000ng/ml)抗原濃度為橫坐標(biāo)、校準(zhǔn)品相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo),可以采用四參數(shù)(4PL)或點對點的擬合方式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并將待測樣品OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,算得待測樣品中MPO濃度。也可使用各種專業(yè)軟件來進行計算。如下所示:如果一樣品的OD值=0.9671,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,算得MPO濃度≈212.82ng/ml。(此校準(zhǔn)品OD值和標(biāo)準(zhǔn)曲線僅為示例說明,不具有實際定量作用;每次實驗以校準(zhǔn)品實際OD值為準(zhǔn))。本發(fā)明的實施例采用比色及雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法相結(jié)合的方法來測定樣品中MPO的活性及總量。加入樣品后,在固相載體上預(yù)包被的抗-MPO特異抗體可與樣品中的MPO結(jié)合,MPO具有使過氧化氫還原的能力:MPO+H2O2→復(fù)合體;復(fù)合體+AH2(供氫體)→H20+MPO+A產(chǎn)物。加入苯酚后生成有色化合物,在505nm處通過比色測定A產(chǎn)物的生成量。若樣品中無MPO時,不顯色。進一步加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗-MPO抗體進行溫育。當(dāng)樣品中存在MPO時,將形成“包被抗體-抗原-酶標(biāo)抗體”復(fù)合物,復(fù)合物上連接的HRP催化顯色劑反應(yīng),生成藍色產(chǎn)物,終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色。若樣品中無MPO時,不顯色。顯色深淺與樣本中MPO的含量呈正比。下面詳細描述本發(fā)明提供的人髓過氧化物酶定量檢測試劑盒的制備方法的一個實施例。本實施例主要包括以下步驟:在包被液中按照包被量為200~400ng/孔加入抗-MPO抗體,充分混勻后進行包被,包被完成后將酶標(biāo)板置于2-8℃環(huán)境放置14~16個小時后取出,洗板機各洗板1次,拍干后,200μl/孔加入1中配制好封閉液,37℃溫箱放置150±15分鐘后取出,甩干并拍干,并干燥24-26個小時;按照使用量1:2000~1:8000在酶標(biāo)抗體稀釋液中加入HRP標(biāo)記抗體,充分混勻;分別配置如權(quán)利要求1-7中任一項所述的校準(zhǔn)品、洗滌液、顯色底物和終止液。制備方法實例1包括MPO固相載體的制備、MPO酶標(biāo)抗體試劑的制備、MPO校準(zhǔn)品的制備,其余組分(包括顯色底物A、顯色底物B、終止液、濃縮洗滌液(20X))制備,主要過程如下:一、MPO固相載體的制備1、固相載體包被液、封閉液的配制:配方詳見下表1和表2。表1、包被液配方原材料名稱配制1000ml用量Na2CO31.59gNaHCO32.93g先加入900ml純化水,待全部物體溶解后,調(diào)整pH值為9.6±0.1,再定容至1000ml。表2、封閉液配方原材料名稱配制1000ml用量BSA10.0g蔗糖52.0g酪蛋白5.0g明膠5.0ml50mMTB8.050mlTritonX-10010mlProclin3001.0ml先加入800ml純化水,待全部物體溶解后,再定容至1000ml。2、酶標(biāo)板的制備:2.1包被:取1中配制好包被液,加入包被抗體(海肽生物科技(上海)有限公司生產(chǎn);包被量在200~400ng/孔),充分混勻后進行包被,包被完成后將酶標(biāo)板(蘇州康容生物醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn))置于2-8℃環(huán)境放置14~16個小時;2.2封閉:將包被酶標(biāo)板從2-8℃環(huán)境中取出,洗板機各洗板1次,拍干后,200μl/孔加入1中配制好封閉液,37℃溫箱放置150±15分鐘;2.3干燥:將封閉好酶標(biāo)板從溫箱里取出,甩干并拍干,干燥房干燥24-26個小時;二、MPO酶標(biāo)抗體試劑的制備1、酶標(biāo)抗體稀釋液的配制:配方詳見表3表3、酶標(biāo)抗體稀釋液配方原材料名稱配制1000ml用量BSA10.0g蔗糖52.0g酪蛋白5.0gNBS100ml明膠5ml50mMTB8.050mlProclin3001ml先加入800ml純化水,待全部物體溶解后,再定容至1000ml。2、酶標(biāo)抗體試劑的配制:2.1取1中配制好酶標(biāo)抗體稀釋液,加入HRP標(biāo)記抗體(海肽生物科技(上海)有限公司;使用量1:2000~1:8000),充分混勻;三、MPO校準(zhǔn)品的制備其中,所述校準(zhǔn)品具體包括有作為校準(zhǔn)品稀釋液的校準(zhǔn)品1和含有MPO抗原的校準(zhǔn)品2-6;目前MPO尚沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品或國際參考品,本實施例采用的是外購的人源MPO抗原,經(jīng)美國ClevelandHeartLab生產(chǎn)的CardioMPOTM酶聯(lián)免疫試劑盒(Cat#7601)進行量值的溯源定值后,系列稀釋作為試劑盒的校準(zhǔn)品。1、校準(zhǔn)品稀釋液的配制:配方詳見表4表4、校準(zhǔn)品稀釋液配方先加入600ml純化水,待全部物體溶解后,再定容至1000ml。2、試劑盒校準(zhǔn)品的制備:2.1試劑盒校準(zhǔn)品配制:根據(jù)人源MPO蛋白(ART)說明書和溯源賦值濃度,用1中配制好校準(zhǔn)品稀釋液分別配制成1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml、50ng/ml和0ng/ml,作為試劑盒校準(zhǔn)品;四濃縮洗滌液(20x)的制備濃縮洗滌液(20x)的配制:配方詳見表5表5、20X濃縮洗滌液配方原材料名稱配制1000ml用量Na2HPO4·12H2O71.6gKH2PO44.8gNaCl160gKCl4gTween-2020ml先加入700ml純化水,待全部物體溶解后,再定容至1000ml。五、TMB顯色底物的制備TMB顯色底物液包含A、B兩種組份,分開配制,配方詳見表6表6、TMB顯色底物A液、B液配方顯色底物A液配制:先加入800ml純化水,待全部物體溶解后,再定容至1000ml。顯色底物B液配制:(1)先將稱量好的TMB溶于DMSO中,完全溶解、混勻,待定容前加入;(2)先加入800ml純化水,待全部物體溶解后,再加入步驟(1)中的TMB-DMSO溶液和甘油,定容至1000ml。六終止液生產(chǎn)工藝終止液的配制:配方詳見表7表7、終止液配方原材料名稱配制1000ml用量濃硫酸108ml取800ml純化水置于燒杯中,緩慢加入濃硫酸,最后定容為1000ml。經(jīng)過試驗,采用本實施例的方法制備的試劑盒具有以下特性:高值質(zhì)控品P1測定濃度在600~800ng/ml之間;中值質(zhì)控品P2測定濃度在200~400ng/ml之間;低值質(zhì)控品P3測定濃度在70~150ng/ml之間。精密度:批內(nèi)變異系數(shù)≤10%,批間變異系數(shù)≤15%。線性回歸系數(shù):在50ng/ml~1000ng/ml范圍內(nèi)R2≥0.980(r≥0.990)。最低檢測限不高于20ng/ml。準(zhǔn)確性:試劑盒校準(zhǔn)品的實測值與標(biāo)示值的比值應(yīng)在0.850~1.150之間。特異性分析:血紅蛋白5mg/ml、甘油三酯10mg/ml、膽紅素0.2mg/ml時、促紅細胞生成素(EPO)50IU/ml時,用于本試劑盒的干擾實驗檢測,均無特異性反應(yīng),對試劑定量結(jié)果沒有影響。穩(wěn)定性:在2~8℃可以穩(wěn)定保存12個月。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明,不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域:
的普通技術(shù)人員來說,在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下,還可以做出若干簡單推演或替換,都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3