1.一種人髓過(guò)氧化物酶活性及總量檢測(cè)試劑盒,其特征在于,包括有固相載體、酶分解底物、緩沖液、酶標(biāo)抗體試劑、校準(zhǔn)品、洗滌液、顯色底物和終止液,其中:
所述固相載體包被有200~400ng/孔的抗-MPO非抑制性抗體;
所述酶分解底物包括有0.1-50mmol/L的H2O2;
所述酶標(biāo)抗體試劑含有使用量為1:2000~1:8000的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗-MPO抑制性抗體;
所述校準(zhǔn)品包括有MPO抗原含量為0-1000ng/ml的多個(gè)校準(zhǔn)品;
所述顯色底物至少包括含有0.015-0.02%的過(guò)氧化物的顯色底物A液和含有0.25-0.32g/L的TMB顯色底物B液。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述固相載體采用含有以下組分的包被液包被所述抗-MPO非抑制性抗體:
Na2CO3:1.0-2.1g/L;
NaHCO3:2.5-3.5g/L;
和/或者,所述固相載體采用含有以下組分的封閉液封閉所述抗-MPO非抑制性抗體:
BSA:1.0-10.0g/L;
蔗糖:40.0-60.0g/L;
酪蛋白:1.0-10.0g/L;
明膠:1.0-10.0ml/L;
50mM TB 8.0:40.0-60.0ml/L;
Triton X-100:1.0-300ml/L;
Proclin300:0.5-2.0ml/L。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述液緩沖包括以下組分:
檸檬酸:6.0-10.0g/L;
檸檬酸鈉:10.0-15.0g/L;
苯酚:0.5-1.5g/L;
BSA:0.1-2.0g/L;
和/或者,所述酶分解底物溶液包括有以下組分:
H2O2:0.2-10.0ml/L;
4-氨基安替吡啉(sigma):1.0-10.0g/L;
BSA:0.1-5.0g/L。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述酶標(biāo)抗體試劑采用含有以下組分的稀釋液:
BSA:1.0-20.0g/L;
蔗糖:20.0-80.0g/L;
酪蛋白:1.0-10.0g/L;
NBS:80.0-120.0ml/L;
明膠:1.0-10.0ml/L;
50mM TB 8.0:40.0-60.0ml/L;
Proclin300:0.5-1.5ml/L。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述校準(zhǔn)品包括有人源MPO抗原含量分別為1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml、50ng/ml和0ng/ml的至少一種校準(zhǔn)品;且所述校準(zhǔn)品采用含有以下組分的校準(zhǔn)品稀釋液:
Na2HPO4·12H2O:40.0-65.0g/L;
NaH2PO4·2H2O:5.0-10.0g/L;
NBS:150.0-250.0ml/L;
甘油:25.0-80.0ml/L;
Tween-20:0.1-2.0ml/L;
Proclin300:0.1-2.0ml/L。
6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述顯色底物A液包括以下組分:
三水合乙酸鈉:20.0-40.0g/L;
檸檬酸:2.0-5.0g/L;
30%H2O2:0.5-0.8ml/L;
和/或者,所述顯色底物B液包括以下組分:
乙二胺四乙酸二鈉:0.1-0.8g/L;
檸檬酸:1.0-3.0g/L;
甘油:50.0-150.0ml/L;
TMB:0.1-0.5g/L;
DMSO:1.0-10.0ml。
7.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述濃縮洗滌液包括以下組分:
Na2HPO4·12H2O:50.0-100.0g/L;
KH2PO4:2.0-8.0g/L;
NaCl:100.0-200.0g/L;
KCl:2.0-6.0g/L;
Tween-20:10.0-30.0ml/L。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的試劑盒,其特征在于:
所述固相載體為酶標(biāo)板或平底試管。
9.一種人髓過(guò)氧化物酶活性及總量檢測(cè)方法,用于采用權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的試劑盒對(duì)人血清或血漿中的人髓過(guò)氧化物酶進(jìn)行活性及總量檢測(cè)方法,其特征在于,包括:
在酶標(biāo)板的每孔中加入100ul濃度為5ug/ml的抗-MPO非抑制性抗體和50mM碳酸鹽緩沖液,調(diào)節(jié)pH值為9.6,在4℃條件下靜止8-12小時(shí)后,去除緩沖液;
在酶標(biāo)板的每孔中加入200μl封閉液,在4℃條件下封閉2小時(shí)后,去除封閉液;
在酶標(biāo)板的每孔中加入80ul樣品稀釋液和20ul血清或血漿樣品,在室溫下反應(yīng)30分鐘后,去除稀釋液;
加入200ul緩沖液和50ul酶分解底物,混合反應(yīng)2分鐘后,測(cè)定OD值;
繪制酶活性-OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線,算得待測(cè)樣品中MPO酶活性;
測(cè)定OD值后立即去除酶標(biāo)板中的反應(yīng)液,洗滌封閉;
加入酶標(biāo)抗體試劑100μl,置37℃繼續(xù)溫育30分鐘;
在酶標(biāo)板的每孔中加入顯色底物A液和顯色底物B液各50μl混勻,37℃避光顯色15分鐘后,每孔加終止液50μl,混勻后10分鐘內(nèi),測(cè)定校準(zhǔn)品和待檢樣品的OD值;
以校準(zhǔn)品抗原濃度為橫坐標(biāo)、校準(zhǔn)品相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并將待測(cè)樣品OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,算得待測(cè)樣品中MPO濃度。
10.一種人髓過(guò)氧化物酶活性及總量檢測(cè)試劑盒的制備方法,其特征在于,包括:
在包被液中按照包被量為200~400ng/孔加入抗-MPO非抑制性抗體,充分混勻后進(jìn)行包被,包被完成后將酶標(biāo)板置于2-8℃環(huán)境放置14~16個(gè)小時(shí)后取出,洗板機(jī)各洗板1次,拍干后,200μl/孔加入1中配制好封閉液,37℃溫箱放置150±15分鐘后取出,甩干并拍干,并干燥24-26個(gè)小時(shí);
按照使用量1:2000~1:8000在酶標(biāo)抗體稀釋液中加入HRP標(biāo)記抗體,充分混勻;
分別配置如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的校準(zhǔn)品、洗滌液、顯色底物和終止液。