本發(fā)明涉及醫(yī)療衛(wèi)生部門的應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種人類精子線粒體功能檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和醫(yī)療水平的提高，不孕不育的發(fā)病率反而呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，已成為當(dāng)今影響人類生活和健康的一類主要疾病，其中在我國(guó)，不孕不育癥在育齡期夫婦中發(fā)病率達(dá)10％以上，并有逐漸增多的趨勢(shì)。男性因素和女性因素各占30％，雙方共同因素占40％。男性因素中精子原因居首位。世界衛(wèi)生組織(WHO)在25個(gè)國(guó)家9000對(duì)不育夫婦的多中心研究中發(fā)現(xiàn)，50％的男性不育癥是特發(fā)性精子異常。精子活力是衡量精液質(zhì)量和男性生育力的一個(gè)重要指標(biāo)。男科學(xué)上把精子因活力不足而導(dǎo)致的男性生育能力低下，稱為弱精子癥或精子活力低下。在男性不育患者中弱精子癥約占19％，已成為影響男性生育力的常見病因。精子尾部中段主要由線粒體構(gòu)成，線粒體活性的改變會(huì)影響精子的能量供應(yīng)，精子持續(xù)運(yùn)動(dòng)能力，而且線粒體還是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中樞。因此，線粒體的功能狀態(tài)是精子功能質(zhì)量的一個(gè)關(guān)鍵性指標(biāo)。線粒體活性的評(píng)價(jià)主要通過(guò)檢測(cè)線粒體的跨膜電位變化來(lái)分析。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡(jiǎn)單、結(jié)果易于判定、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好、且易于臨床推廣的人類精子線粒體功能檢測(cè)方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種人類精子線粒體功能檢測(cè)方法，包括如下步驟：
(1)將液化的精液用37℃緩沖液稀釋精子至1～2×106個(gè)/mL，每個(gè)標(biāo)本處理兩管，分別作為對(duì)照管和檢測(cè)管；
(2)將500μL稀釋過(guò)的精子加入到流式細(xì)胞儀上樣管中，同時(shí)加入5μL的JC-1染液，避光染色15分鐘，其中對(duì)照管置于85℃條件下2分鐘，滅活，檢測(cè)管置于37℃條件下保持活力；
(3)設(shè)定流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)，對(duì)照管、檢測(cè)管按順序上機(jī)，每管樣本至少連續(xù)測(cè)定兩次，每管樣本至少記錄樣本主群5000個(gè)細(xì)胞并使用MMP軟件統(tǒng)計(jì)分析；
(4)根據(jù)MMP軟件統(tǒng)計(jì)分析得出結(jié)果，將37℃正常處理樣本百分比減去85℃高溫處理后的空白樣本百分比，得到的MMP百分比差值即區(qū)分出正常人群百分比數(shù)值；
(5)測(cè)定后，分別用漂白劑、進(jìn)樣管清潔劑和除菌的雙蒸水徹底清除殘留于流式細(xì)胞儀進(jìn)樣線中的細(xì)胞碎片和熒光染料。
步驟(1)中所述的緩沖液為氯化鈉、磷酸二氫鉀、葡萄糖、氯化鉀、酸鎂、氯化鈣、N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸二鈉鹽、碳酸氫鈉、丙酮酸鈉、牛血清白蛋白和乳酸鈉的混合物。
步驟(2)中所述的JC-1染色液為JC-1和二甲基亞砜的混合物。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明一種人類精子線粒體功能檢測(cè)方法，該方法采用對(duì)線粒體膜電位變化敏感的染料JC-1，親脂性陽(yáng)離子熒光染料5,5′，6,6′-四氯-1,1′,3，3′-四乙基苯并咪唑基-羰化青碘(5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanineiodide，JC-1)，是檢測(cè)精子線粒體膜電位△ψm最理想的染料。正常精子線粒體膜電位△ψm高，在膜內(nèi)JC-1以聚合體存在，發(fā)橙色光；異常精子線粒體膜電位△ψm降低，JC-1以單體形式存在，發(fā)綠色光，其采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果易于判定、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好、且易于臨床推廣的優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
具體實(shí)施例
一種人類精子線粒體功能檢測(cè)方法，包括如下步驟：
(1)將液化的精液用37℃緩沖液稀釋精子至1～2×106個(gè)/mL，每個(gè)標(biāo)本處理兩管，分別作為對(duì)照管和檢測(cè)管；
(2)將500μL稀釋過(guò)的精子加入到流式細(xì)胞儀上樣管中，同時(shí)加入5μL的JC-1染液，避光染色15分鐘，其中對(duì)照管置于85℃條件下2分鐘，滅活，檢測(cè)管置于37℃條件下保持活力；
(3)設(shè)定流式細(xì)胞儀的校準(zhǔn)，對(duì)照管、檢測(cè)管按順序上機(jī)，每管樣本至少連續(xù)測(cè)定兩次，每管樣本至少記錄樣本主群5000個(gè)細(xì)胞并使用MMP軟件統(tǒng)計(jì)分析；
(4)根據(jù)MMP軟件統(tǒng)計(jì)分析得出結(jié)果，將37℃正常處理樣本百分比減去85℃高溫處理后的空白樣本百分比，得到的MMP百分比差值即區(qū)分出正常人群百分比數(shù)值；
(5)測(cè)定后，分別用漂白劑、進(jìn)樣管清潔劑和除菌的雙蒸水徹底清除殘留于流式細(xì)胞儀進(jìn)樣線中的細(xì)胞碎片和熒光染料。
上述漂白劑為50％的雙蒸水ddH2O和50％約含5％的次氯酸鈉的混合物，進(jìn)樣管清潔劑為50％的乙醇、50％的漂白劑和0.5M NaCl的混合物。
當(dāng)然，上述說(shuō)明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)做出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。