本發(fā)明涉及煙草及煙草制品化學成分測定方法，具體涉及一種煙草及煙草制品中煙堿的手性分析高效液相色譜法。

背景技術(shù)：

煙堿，也叫尼古丁，是一種存在于茄科植物中的生物堿，也是煙草的重要成分。煙堿分子含有一個手性中心，即四氫吡咯環(huán)上的2位碳原子，所以煙堿有兩個對映體：S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿。煙堿的兩個對映體具有完全不同含量、代謝機理和生理特性。因此需進行煙草及煙草制品中煙堿的手性分析。

目前關(guān)于煙堿的手性分析，主要是采用氣相色譜法進行研究，例如申請?zhí)枮?01610663534.1的專利《一種卷煙煙絲中煙堿的手性分析方法》，該方法前處理步驟復雜，并且檢測時間達到140min，不能滿足大量樣品的檢測，目前尚未有關(guān)于煙草及煙草制品中煙堿的手性分析的高效液相色譜方法。因此有必要開發(fā)一種靈敏度高、精密度好、適合大批量準確定量煙草及煙草制品中S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的方法。手性柱-正相液相色譜紫外檢測器在異構(gòu)體分離方面有著明顯的優(yōu)勢，因此通過大量實驗建立了煙草及煙草制品中煙堿手性的正相液相色譜紫外檢測分析方法，該方法更適合用于大量樣品中煙堿的手性分析。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的正是以煙堿為研究對象，對煙草及煙草制品樣品進行了前處理方法研究，建立了手性柱-正相液相色譜紫外檢測的煙草及煙草制品中煙堿旋光異構(gòu)體的分析方法，實現(xiàn)了對煙草及煙草制品中煙堿旋光對映體S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的準確測定。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：將煙草及煙草制品樣品干燥、粉碎和過篩，樣品經(jīng)過氫氧化鈉溶液浸潤后，采用甲基叔丁基醚和甲醇溶液萃取，萃取液經(jīng)基質(zhì)分散固相萃取凈化后，使用手性柱-正相液相色譜紫外檢測器分析，采用峰面積歸一化法定量檢測煙草及煙草制品中S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的比例。具體步驟如下：

1. 標準溶液的配制：稱取約100.0 mg的S-(-)-煙堿標準品，用正己烷和甲醇溶液（98:2，V/V）稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成濃度約為2.0 mg/mL的S-(-)-煙堿標準儲備液；稱取約50.0 mg的R-(+)-煙堿標準品，用正己烷和甲醇溶液（98:2，V/V）稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成濃度約為1.0 mg/mL的R-(+)-煙堿標準儲備液；利用S-(-)-煙堿標準儲備液和R-(+)-煙堿標準儲備液稀釋，配制S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿濃度分別為100 μg/mL和5 μg/mL的混合標準溶液，另外分別稀釋得到100 μg/mL的S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿標準溶液。

2. 煙草及煙草制品樣品的混勻：將煙草及煙草制品樣品置于40 ^oC烘箱中，1小時后將煙草及煙草制品取出，粉碎后過0.45毫米孔徑標準篩。

3. 煙草及煙草制品樣品的萃?。悍Q取0.3 g已粉碎的樣品于15mL具塞離心管中，加入2.0 mL 5% 的氫氧化鈉溶液，渦旋1min混勻后靜置10 min浸潤樣品。取10 mL甲基叔丁基醚和甲醇（90:10，V/V）溶液到離心管中，并于旋渦混合器上以4000 rpm速度振蕩30 min。

4. 萃取液的凈化：取1.5 mL萃取上清液于2 mL凈化離心管中（內(nèi)含150 mg無水硫酸鎂，25 mg PSA吸附劑，7.5 mg GCB吸附劑，統(tǒng)稱基質(zhì)分散固相萃取材料），于旋渦混合器上以4000 rpm振蕩2 min，以10000 rpm離心1min。取上清液過0.45 μm有機相濾膜后進液相分析。

5. 正相高效液相色譜條件：采用對照標樣（即混合標準溶液）與樣品中煙堿色譜峰的保留時間進行S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的定性分析，對峰面積進行歸一化定量S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿占總煙堿的比例。分析柱為Chiralcel OD-H液相色譜柱(柱長 250 mm ，內(nèi)徑4.6 mm ，固定相粒徑5 μm)；流動相為正己烷和甲醇溶液（98:2 ，V/V），流速1 mL/min；等度洗脫；柱溫30 ℃；進樣體積 10 μL；紫外檢測器檢測波長252 nm；分析時間15 min。

本發(fā)明提供了一種煙草及煙草制品中煙堿的手性分析高效液相色譜法，具有以下優(yōu)良效果：可減低樣品液對色譜柱的污染，液相檢測方法靈敏度高，分析時間短，能實現(xiàn)對S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的基線分離，R-(+)-煙堿的檢出限（LOD）為0.08%，能夠滿足大批量煙草及煙草制品樣品中煙堿的手性分析。

附圖說明

圖1為混合標準溶液的色譜圖，

圖2為煙草及煙草制品樣品的色譜圖。

具體實施方式

本發(fā)明通過以下具體實施例作進一步描述，但不限制本發(fā)明。

1. 儀器和試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀配制紫外檢測器（美國Agilent公司），AE163電子天平（感量：0.0001 g，瑞士Mettler公司），高速粉碎機（武漢銀彩科技有限公司），美國Coleparmer Votex-Genie漩渦振蕩器，德國SIGMA 3-30K-高速臺式冷凍型離心機。正己烷（色譜純），氫氧化鈉（分析純），甲醇（色譜純），，S-(-)-煙堿標準品（CAS：54-11-5），R-(+)-煙堿標準品（CAS：25162-00-9）。

2. 標準溶液的配制

稱取約100.0 mg的S-(-)-煙堿標準品，用正己烷和甲醇溶液（98:2，V/V）稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成濃度約為2.0 mg/mL的S-(-)-煙堿標準儲備液；稱取約50.0 mg的R-(+)-煙堿標準品，用正己烷和甲醇溶液（98:2，V/V）稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成濃度約為1.0 mg/mL的R-(+)-煙堿標準儲備液；利用S-(-)-煙堿標準儲備液和R-(+)-煙堿標準儲備液稀釋，配制S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿濃度分別為100 μg/mL和5 μg/mL的混合標準溶液，另外分別稀釋得到100 μg/mL的S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿標準溶液。

3. 煙草及煙草制品樣品的混勻：將煙草及煙草制品樣品置于40 ^oC烘箱中，1小時后將煙草及煙草制品取出，粉碎后過0.45毫米孔徑標準篩。

4. 煙草及煙草制品樣品的萃?。悍Q取0.3 g已粉碎的樣品于15mL具塞離心管中，加入2.0 mL 5% 的氫氧化鈉溶液，渦旋1min混勻后靜置10 min浸潤樣品。取10 mL甲基叔丁基醚和甲醇（90:10，V/V）溶液到離心管中，并于旋渦混合器上以4000 rpm速度振蕩30 min。

5. 萃取液的凈化：取1.5 mL上清液于2 mL凈化離心管中（內(nèi)含150 mg無水硫酸鎂，25 mg PSA吸附劑，7.5 mg GCB吸附劑），于旋渦混合器上以4000 rpm振蕩2 min，以10000 rpm離心1min。取上清液過0.45 μm有機相濾膜后進液相分析。

6. 正相高效液相色譜條件：采用對照標樣與樣品中煙堿色譜峰的保留時間進行S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的定性分析，對峰面積進行歸一化定量S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿占總煙堿的比例。分析柱為Chiralcel OD-H液相色譜柱(柱長 250 mm ，內(nèi)徑4.6 mm ，固定相粒徑5 μm)；流動相為正己烷和甲醇溶液（98:2 ，V/V），流速1 mL/min；等度洗脫；柱溫30 ℃；進樣體積 10 μL；紫外檢測器檢測波長252 nm；分析時間15 min。

7. R-(+)-煙堿的檢出限

煙堿的手性組成通常以R-(+)-煙堿占總煙堿的百分比來表示。為評估R-(+)-煙堿的檢出限，本發(fā)明方法在S-(-)-煙堿的標準溶液中加入R-(+)-煙堿的標準溶液。結(jié)果表明，S-(-)-煙堿的標準溶液中即可觀察到R-(+)-煙堿的響應(yīng)信號，對定量離子峰面積進行歸一化后，S-(-)-煙堿的標準溶液中R-(+)-煙堿的比例為0.08%（峰面積相對于總煙堿峰面積），以此作為本方法R-(+)-煙堿的檢出限。

8. 煙草及煙草制品樣品中煙堿的手性分析實例

將按照上述步驟處理的煙草及煙草制品樣品進行正相高效液相色譜分析；采用對照標樣與煙草及煙草制品樣品煙堿色譜峰的保留時間進行S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的定性分析，對峰面積進行歸一化定量S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿占總煙堿的比例。

采用該方法對10個煙草及煙草制品樣品進行了分析，結(jié)果見表1。

9. 分析方法的精密度

取同一煙草及煙草制品樣品進行5次日內(nèi)和日間平行測定，考察了本發(fā)明方法的精密度，結(jié)果見表2和表3。結(jié)果表明，煙草及煙草制品樣品中R-(+)-煙堿的日內(nèi)和日間測定結(jié)果的變異系數(shù)分別為4.48%和7.73%，精密度較好。

采用具體實施方式中的方法對上述10個煙草及煙草制品樣品進行了檢測。檢測得到的色譜圖如圖1和圖2所示。