本發(fā)明涉及無煙氣煙草制品化學成分測定方法，具體涉及一種無煙氣煙草制品中煙堿的手性分析合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。

背景技術(shù)：

煙堿，也叫尼古丁，是一種存在于茄科植物中的生物堿，也是煙草的重要成分。煙堿分子含有一個手性中心，即四氫吡咯環(huán)上的2位碳原子，所以煙堿有兩個對映體：S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿。煙堿的兩個對映體具有完全不同含量、代謝機理和生理特性。因此需進行無煙氣煙草制品（袋裝口含煙）中煙堿的手性分析。

目前關(guān)于煙堿的手性分析，主要是采用氣相色譜法進行研究，例如申請?zhí)枮?01610663534.1的專利《一種卷煙煙絲中煙堿的手性分析方法》，該方法前處理步驟復雜，并且檢測時間達到140min，不能滿足大量樣品的檢測，目前尚未有關(guān)于無煙氣煙草制品中煙堿的手性分析方法。因此有必要開發(fā)一種靈敏度高、精密度好、適合大批量準確定量無煙氣煙草制品中S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的方法。手性柱-合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜在異構(gòu)體分離方面有著明顯的優(yōu)勢，因此通過大量實驗建立了無煙氣煙草制品中煙堿手性的手性柱-合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，該方法更適合用于大量樣品中煙堿的手性分析。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的正是以煙堿為研究對象，對無煙氣煙草制品樣品進行了前處理方法研究，建立了串聯(lián)手性柱-合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測無煙氣煙草制品中煙堿旋光異構(gòu)體的分析方法，實現(xiàn)了對無煙氣煙草制品中煙堿旋光對映體S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的準確測定。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：將無煙氣煙草制品樣品干燥、粉碎和過篩，樣品經(jīng)過氫氧化鈉溶液浸潤后，采用甲基叔丁基醚和甲醇溶液萃取，萃取液經(jīng)基質(zhì)分散固相萃取凈化后，使用串聯(lián)手性柱-合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析，采用峰面積歸一化法定量檢測無煙氣煙草制品中S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的比例。具體步驟如下：

1. 標準溶液的配制：稱取約100.0 mg的S-(-)-煙堿標準品，用甲醇溶液稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成濃度約為2.0 mg/mL的S-(-)-煙堿標準儲備液；稱取約50.0 mg的R-(+)-煙堿標準品，用甲醇溶液稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成濃度約為1.0 mg/mL的R-(+)-煙堿標準儲備液；利用S-(-)-煙堿標準儲備液和R-(+)-煙堿標準儲備液稀釋配制S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿濃度分別為100 μg/mL和80 μg/mL的混合標準溶液。

2.無煙氣煙草制品樣品的混勻：將無煙氣煙草制品樣品置于40 ℃烘箱中，1小時后將無煙氣煙草制品取出，粉碎后過0.45毫米孔徑標準篩。

3. 無煙氣煙草制品樣品的萃?。悍Q取0.3 g已粉碎的樣品于15 mL具塞離心管中，加入2.0 mL 5% 的氫氧化鈉溶液，渦旋1 min混勻后靜置10 min浸潤樣品。取10 mL甲基叔丁基醚和甲醇（90:10，V/V）溶液到離心管中，并于旋渦混合器上以4000 rpm速度振蕩30 min。

4. 萃取液的凈化：取1.5 mL上清液于2 mL凈化離心管中（內(nèi)含150 mg無水硫酸鎂，25 mg PSA吸附劑，7.5 mg GCB吸附劑，統(tǒng)稱基質(zhì)分散固相萃取材料），于旋渦混合器上以4000 rpm振蕩2 min，以10000 rpm離心1 min。取上清液過0.45 μm有機相濾膜后進合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

5. 串聯(lián)手性柱-合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法條件：分析柱1為Trefoil CEL1柱（柱長 150 mm ，內(nèi)徑3.0 mm ，固定相粒徑2.5 μm），分析柱2為Chiralcel OD-H液相色譜柱(柱長 250 mm ，內(nèi)徑4.6 mm ，固定相粒徑5 μm)；流動相A為：CO₂，流動相B：含0.05%異丙胺的甲醇；流速為1.1 mL/min；梯度洗脫條件為：0.0 min，97% A；0.5 min，97% A；8.0 min，92% A；10.0 min，92% A；10.2 min，97% A；12.0 min，97% A。柱溫40 ℃；進樣室溫度：10 ℃；進樣體積2 μL；背壓：1600 psi；ISM補償流路流動相為含0.1%甲酸的甲醇，流速為0.3 mL/min。分析時間總計12 min。質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧源，掃描方式為正離子掃描，離子源溫度為300 ℃，電噴霧電壓為5000 V，霧化氣壓力為40 psi；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；MRM參數(shù)見下表。通過對峰面積進行歸一化定量S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿占總煙堿的比例。

本發(fā)明提供了一種無煙氣煙草制品中煙堿的手性分析合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，具有以下優(yōu)良效果：可降低樣品液對色譜柱的污染，合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測方法靈敏度高，特異性好，可避免假陽性，分析時間短，能實現(xiàn)對S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的基線分離，R-(+)-煙堿的檢出限（LOD）為0.04%，能夠滿足大批量無煙氣煙草制品樣品中煙堿的手性分析。

附圖說明

圖1為混合標準溶液的色譜圖，

圖2為無煙氣煙草制品樣品的色譜圖。

具體實施方式

本發(fā)明通過以下具體實施例作進一步描述，但不限制本發(fā)明。

1. 儀器和試劑

ACQUITY UPC2超高效合相色譜儀（美國Waters公司），6410B三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀（美國Agilent公司），AE163電子天平（感量：0.0001 g，瑞士Mettler公司），高速粉碎機（武漢銀彩科技有限公司），美國ColeparmerVotex-Genie漩渦振蕩器，德國SIGMA 3-30K-高速臺式冷凍型離心機。甲基叔丁基醚（色譜純），氫氧化鈉（分析純），甲酸（色譜純），甲醇（色譜純），S-(-)-煙堿標準品（CAS：54-11-5），R-(+)-煙堿標準品（CAS：25162-00-9）。

2. 標準溶液的配制

稱取約100.0 mg的S-(-)-煙堿標準品，用甲醇溶液稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成濃度約為2.0 mg/mL的S-(-)-煙堿標準儲備液；稱取約50.0 mg的R-(+)-煙堿標準品，用甲醇溶液稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成濃度約為1.0 mg/mL的R-(+)-煙堿標準儲備液；利用S-(-)-煙堿標準儲備液和R-(+)-煙堿標準儲備液稀釋配制S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿濃度分別為100 μg/mL和80 μg/mL的混合標準溶液。

3.無煙氣煙草制品樣品的混勻：將無煙氣煙草制品樣品置于40 ℃烘箱中，1小時后將無煙氣煙草制品取出，粉碎后過0.45毫米孔徑標準篩。

4. 無煙氣煙草制品樣品的萃?。悍Q取0.3 g已粉碎的樣品于15mL具塞離心管中，加入2.0mL 5% 的氫氧化鈉溶液，渦旋1min混勻后靜置10 min浸潤樣品。取10 mL甲基叔丁基醚和甲醇（90:10，V/V）溶液到離心管中，并于旋渦混合器上以4000 rpm速度振蕩30 min。

5. 萃取液的凈化：取1.5 mL上清液于2 mL凈化離心管中（內(nèi)含150 mg無水硫酸鎂，25 mg PSA吸附劑，7.5 mg GCB吸附劑），于旋渦混合器上以4000 rpm振蕩2 min，以10000 rpm離心1min。取上清液過0.45 μm有機相濾膜后進合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

6. 串聯(lián)手性柱-合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法條件：分析柱1為Trefoil CEL1柱（柱長 150 mm ，內(nèi)徑3.0 mm ，固定相粒徑2.5 μm），分析柱2為Chiralcel OD-H液相色譜柱(柱長 250 mm ，內(nèi)徑4.6 mm ，固定相粒徑5 μm)；流動相A為：CO₂，流動相B：含0.05%異丙胺的甲醇；流速為1.1 mL/min；梯度洗脫條件為：0.0 min，97% A；0.5 min，97% A；8.0 min，92% A；10.0 min，92% A；10.2 min，97% A；12.0 min，97% A。柱溫40 ℃；進樣室溫度：10 ℃；進樣體積2 μL；背壓：1600 psi；ISM補償流路流動相為含0.1%甲酸的甲醇，流速為0.3 mL/min。分析時間總計12 min。質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧源，掃描方式為正離子掃描，離子源溫度為300 ℃，電噴霧電壓為5000 V，霧化氣壓力為40 psi；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；MRM參數(shù)見下表。通過對峰面積進行歸一化定量S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿占總煙堿的比例。

7. R-(+)-煙堿的檢出限

煙堿的手性組成通常以R-(+)-煙堿占總煙堿的百分比來表示。為評估R-(+)-煙堿的檢出限，本發(fā)明方法在S-(-)-煙堿的標準溶液中加入R-(+)-煙堿的標準溶液。結(jié)果表明，S-(-)-煙堿的標準溶液中即可觀察到R-(+)-煙堿的響應(yīng)信號，對定量離子峰面積進行歸一化后，S-(-)-煙堿的標準溶液中R-(+)-煙堿的比例為0.04%（峰面積相對于總煙堿峰面積），以此作為本方法R-(+)-煙堿的檢出限。

8. 無煙氣煙草制品樣品中煙堿的手性分析實例

將按照上述步驟處理的無煙氣煙草制品樣品進行合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析；采用無煙氣煙草制品煙堿MRM離子進行定性分析，對峰面積進行歸一化定量S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿占總煙堿的比例。

采用該方法對4個無煙氣煙草制品樣品進行了分析，結(jié)果見表1。

9. 分析方法的精密度

取同一無煙氣煙草制品樣品進行5次日內(nèi)和日間平行測定，考察了本發(fā)明方法的精密度，結(jié)果見表2和表3。結(jié)果表明，無煙氣煙草制品樣品中R-(+)-煙堿的日內(nèi)和日間測定結(jié)果的變異系數(shù)分別為2.19%和5.06%，精密度較好。

采用具體實施方式中的方法對上述4個無煙氣煙草制品樣品進行了檢測。檢測得到的色譜圖如圖1和圖2所示。