本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于動物源樣品中痕量F-2毒素代謝分析的方法。

背景技術(shù)：

F-2毒素，又稱玉米烯酮（ZEN），是由禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌及串珠鐮刀菌等產(chǎn)生的一類真菌毒素，常見于糧食及動物飼料中，可經(jīng)飲用水和食物對動物健康造成影響，在動物所有食用的樣品中不得檢出。

關(guān)于F-2毒素的檢測，國內(nèi)外已建立了多種方法，主要為薄層色譜法、酶聯(lián)免疫測定法（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC），主要集中于F-2毒素單組分檢測。AOAC于1995年發(fā)布了其官方的薄層色譜法（TLC）分析方法。在我國，1996年發(fā)布的行業(yè)標準“出口糧谷中赤霉烯酮檢驗方法”、2004年發(fā)布的國家標準“飼料中玉米赤霉烯酮的測定”以及2005年發(fā)布的國家標準“糧食衛(wèi)生標準”均采用薄層色譜法。在免疫分析方面，基于生物素-鏈霉親和素的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA），建立了玉米赤霉烯酮（ZEN）的ZEN-ELISA檢測方法。在液相色譜技術(shù)方面，我國對ZEN檢測的研究主要集中ZEN單組分特異性分析，國家標準“谷物中玉米赤霉烯酮的測定”中采用Vieam ZEN免疫親和柱進行高效液相分析檢測。

在F-2毒素代謝分析方面，目前主要應(yīng)用液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜分析技術(shù)，采用梯度洗脫分離方式，聯(lián)用高分辨質(zhì)譜或串聯(lián)質(zhì)譜（MS-MS），采用乙酸銨水溶液與乙腈/甲醇在一定的濃度梯度下洗脫，通過改變流動相中各溶劑組成的比例改變流動相的極性，使每個流出的組分都有合適的容量因子k，并使樣品中的所有組分可在最短時間內(nèi)實現(xiàn)最佳分離，分離效果良好，但儀器要求較高。等度洗脫，流動相的組成比例和流速恒定不變，洗脫操作簡單；熒光檢測靈敏度較高，技術(shù)要求較低，二者的聯(lián)用對于痕量F-2毒素的代謝分析具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于動物源樣品中痕量F-2毒素代謝分析的方法，該方法基于高效液相色譜技術(shù)，集成了在柱富集、等度洗脫和熒光檢測等技術(shù)，用于動物樣品中痕量F-2毒素及代謝組分的快速分離、檢測，流程簡便、操作簡單、靈敏度高。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種用于動物源樣品中痕量F-2毒素代謝分析的方法，以液相色譜分離柱對動物源樣品提取凈化液進行在柱連續(xù)進樣富集，以甲醇-乙腈-水三元混合溶液為流動相，采用恒流等度洗脫和柱后熒光檢測模式，連續(xù)分離檢測動物樣品中痕量F-2毒素及代謝組分，實現(xiàn)F-2毒素動物體內(nèi)代謝反應(yīng)的痕量分析。

所述F-2毒素代謝中的組分包括β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素。

所述的色譜分離柱為十八烷基鍵合硅膠填充柱；

所述的甲醇-乙腈-水三元混合溶液體積比為55：13：32；

所述的熒光檢測模式的激發(fā)波長為274 nm、發(fā)射波長為440 nm。

所述用于動物源樣品中痕量F-2毒素代謝分析的方法，具體包括以下分析步驟：

所述用于動物源樣品中痕量F-2毒素代謝分析的方法，所述動物源樣品為豬的肝臟、肌肉和血清。

所述用于動物源樣品中痕量F-2毒素代謝分析的方法，對于肝臟、肌肉組織樣品分析的具體包括以下步驟：

（1）提取：取1g均質(zhì)的組織樣品，均勻攪碎，置放于10 mL離心管中，加入2.0 mL乙酸鈉溶液、3.0 mL無水乙醚，4000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液；重復(fù)提取一次；合并提取液，40℃下氮氣吹干；

殘渣用0.5mL三氯甲烷溶解，超聲2min，加入1.5mL 0.5mol/L的氫氧化鈉溶液，4000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液；重復(fù)提取一次；合并提取液，40℃下氮氣吹干，得固體備用；

（2）凈化：在步驟（1）得到的固體中加入體積比1：4的磷酸-水溶液0.5mL，混勻后轉(zhuǎn)入PEP固相萃取柱中，先用1.0 mL水淋洗，棄去；采用3.0ml甲醇洗脫，洗脫液于40℃下氮氣吹干，殘渣用體積比為1：3的乙腈-水溶液1.0 mL溶解，過濾，取濾液待測；

（3）在柱富集：以十八烷基鍵合硅膠顆粒填充柱為分離柱；在步驟（2）得到的濾液中加入體積比1：3的乙腈-水混合溶液配制樣品，在柱連續(xù)進樣200μL；

（4）等度洗脫分析：以甲醇、乙腈、水三元混合溶液為流動相，以流速為1.0 mL/min進行恒流等度洗脫；采用熒光檢測方式，激發(fā)波長為274 nm、發(fā)射波長為440 nm，在線測定β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素組分，實現(xiàn)對痕量F-2毒素代謝組分的色譜等度洗脫-熒光檢測。

所述用于動物源樣品中痕量F-2毒素代謝分析的方法，對于血清樣品分析的包括以下步驟：

（1）凈化：取 1mL 血清樣品于 10 mL 離心管中，加入 5.0 mL 乙酸乙酯，渦旋混勻 5min，3000r/min 離心 10 min 取上清液于 10 mL 玻璃離心管中，剩余殘渣用 4.0 mL 乙酸乙酯分兩次清洗，洗液轉(zhuǎn)入玻璃離心管中，40℃水浴氮氣吹干，殘渣加 1.0 mL 流動相溶解，3000 r/min 離心 10min，取上清液過濾，濾液待測；

（2）在柱富集：以十八烷基鍵合硅膠顆粒填充柱為分離柱；在步驟（1）得到的濾液中加入體積比1：3的乙腈-水混合溶液配制樣品，在柱連續(xù)進樣200μL；

（3）等度洗脫分析：以甲醇、乙腈、水三元混合溶液為流動相，以流速為1.0 mL/min進行恒流等度洗脫；采用熒光檢測方式，激發(fā)波長為274 nm、發(fā)射波長為440 nm，在線測定β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素組分，實現(xiàn)對痕量F-2毒素代謝組分的色譜等度洗脫-熒光檢測。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

本發(fā)明集成了在柱富集、等度洗脫和熒光檢測等技術(shù)，提出了一種用于動物樣品中痕量F-2毒素及代謝組分的快速分離、靈敏檢測的便捷的新技術(shù)。針對傳統(tǒng)HPLC方法聯(lián)用質(zhì)譜分析雖然高分辨高靈敏，但是儀器復(fù)雜、操作技術(shù)要求高；常規(guī)紫外光譜檢測簡便，但檢測靈敏度低，不適用于痕量F-2毒素的檢測分析等問題，本發(fā)明引入在線大體積進樣富集技術(shù)，通過在柱高壓連續(xù)進樣，通過調(diào)控有機相濃度，控制區(qū)帶擴散，以實現(xiàn)F-2毒素及代謝組分的高效富集；以三元混合試劑為流動相，采用恒流速等度洗脫方式，實現(xiàn)F-2毒素及代謝組分的快速連續(xù)分離；并聯(lián)用熒光檢測，在線測定分離組分，實現(xiàn)對動物樣品中痕量F-2毒素及代謝組分的在柱富集和痕量分析。本發(fā)明方法流程連續(xù)、高效，無需復(fù)雜的儀器裝備，富集后熒光檢測的靈敏度最低可達0.05 ng/mL，適用于痕量F-2毒素及代謝組分的痕量分析。

附圖說明

圖1為實施例1中連續(xù)進樣富集后F-2毒素代謝組分檢測限，1為β-玉米赤霉烯醇；

圖2為實施例2中豬肌肉中F-2毒素及代謝組分分析，1為β-玉米赤霉烯醇，2為F-2毒素；

圖3為實施例3中豬肝臟中F-2毒素及代謝組分分析，1為β-玉米赤霉烯醇，2為F-2毒素；

圖4為實施例4中豬血清中F-2毒素及代謝組分分析，1為β-玉米赤霉烯醇，2為F-2毒素。

具體實施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

實施例1：

以體積比1：3的乙腈-水混合溶液配制樣品，以十八烷基鍵合硅膠顆粒填充柱為分離柱，在柱連續(xù)進樣200μL；以甲醇、乙腈、水三元混合溶液為流動相，以流速為1.0 mL/min進行恒流等度洗脫；采用熒光檢測方式，激發(fā)波長為274 nm、發(fā)射波長為440 nm，在線測定F-2毒素組分，實現(xiàn)對痕量F-2毒素的色譜等度洗脫-熒光檢測，得到痕量β-玉米赤霉烯醇檢出圖，富集后熒光檢測的靈敏度最低可達0.05 ng/mL（圖1）。

實施例2：

取1g均質(zhì)的豬肌肉樣品，均勻攪碎，置放于10 mL離心管中，加入2.0 mL乙酸鈉溶液、3.0 mL無水乙醚，4000r/min離心10min，上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中；重復(fù)提取一次；合并提取液，40℃下氮氣吹干；殘渣用0.5mL三氯甲烷溶解，超聲2min，加入1.5mL 0.5mol/L的氫氧化鈉溶液，4000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液；重復(fù)提取一次；合并提取液，40℃下氮氣吹干，得固體備用。

在上述固體中加入體積比1：4的磷酸-水溶液0.5mL，混勻后轉(zhuǎn)入PEP固相萃取柱中，先用1.0 mL水淋洗，棄去；采用3.0ml甲醇洗脫，洗脫液于40℃下氮氣吹干，殘渣用體積比為1：3的乙腈-水溶液1.0 mL溶解，過濾，取濾液待測。

以十八烷基鍵合硅膠顆粒填充柱為分離柱；在上述濾液中加入體積比1：3的乙腈-水混合溶液配制樣品，在柱連續(xù)進樣200μL。以甲醇、乙腈、水三元混合溶液為流動相，以流速為1.0 mL/min進行恒流等度洗脫；采用熒光檢測方式，激發(fā)波長為274 nm、發(fā)射波長為440 nm，在線測定β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素等組分，實現(xiàn)對痕量F-2毒素代謝組分的色譜等度洗脫-熒光檢測，得到肌肉中F-2毒素及代謝組分分析譜圖（圖2）。

實施例3：

取1g均質(zhì)的豬肝臟樣品，均勻攪碎，置放于10 mL離心管中，加入2.0 mL乙酸鈉溶液、3.0 mL無水乙醚，4000r/min離心10min，上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中；重復(fù)提取一次；合并提取液，40℃下氮氣吹干；殘渣用0.5mL三氯甲烷溶解，超聲2min，加入1.5mL 0.5mol/L的氫氧化鈉溶液，4000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液；重復(fù)提取一次；合并提取液，40℃下氮氣吹干，得固體備用。

在上述固體中加入體積比1：4的磷酸-水溶液0.5mL，混勻后轉(zhuǎn)入PEP固相萃取柱中，先用1.0 mL水淋洗，棄去；采用3.0ml甲醇洗脫，洗脫液于40℃下氮氣吹干，殘渣用體積比為1：3的乙腈-水溶液1.0 mL溶解，過濾，取濾液待測。

以十八烷基鍵合硅膠顆粒填充柱為分離柱；在上述濾液中加入體積比1：3的乙腈-水混合溶液配制樣品，在柱連續(xù)進樣200μL。以甲醇、乙腈、水三元混合溶液為流動相，以流速為1.0 mL/min進行恒流等度洗脫；采用熒光檢測方式，激發(fā)波長為274 nm、發(fā)射波長為440 nm，在線測定β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素等組分，實現(xiàn)對痕量F-2毒素代謝組分的色譜等度洗脫-熒光檢測，得到肝臟中F-2毒素及代謝組分分析譜圖（圖3）。

實施例4：

取 1.0 mL 血清于 10 mL 離心管中，加入 5.0 mL 乙酸乙酯，渦旋混勻 5min，3000r/min 離心 10 min 取上清液于 10 mL 玻璃離心管中，剩余殘渣用 4.0 mL 乙酸乙酯分兩次清洗，洗液轉(zhuǎn)入玻璃離心管中，40℃水浴氮氣吹干，殘渣加 1.0 mL 流動相溶解，3000 r/min 離心 10min，取上清液過濾，濾液待測。

以十八烷基鍵合硅膠顆粒填充柱為分離柱；在上述濾液中加入體積比1：3的乙腈-水混合溶液配制樣品，在柱連續(xù)進樣200μL。以甲醇、乙腈、水三元混合溶液為流動相，以流速為1.0 mL/min進行恒流等度洗脫；采用熒光檢測方式，激發(fā)波長為274 nm、發(fā)射波長為440 nm，在線測定β-玉米赤霉烯醇、F-2毒素等組分，實現(xiàn)對痕量F-2毒素代謝組分的色譜等度洗脫-熒光檢測（圖4）。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。