本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種細(xì)菌或真菌的活性快速檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

細(xì)菌和真菌廣泛存在于自然界和人體內(nèi)，致病性細(xì)菌和真菌可嚴(yán)重危害生命體健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有三分之一的死亡與細(xì)菌感染性疾病相關(guān)。病原菌侵染機(jī)體引起病變，通常需要：①侵入并定植于機(jī)體；②在宿主體內(nèi)增殖并向其它部位擴(kuò)散；③逃避機(jī)體防御機(jī)制；④釋放毒素或引發(fā)超敏反應(yīng)。其中有活性的病原菌侵入機(jī)體是細(xì)菌感染的第一步，是致病菌引起機(jī)體病變的首要條件，因此快速、準(zhǔn)確、靈敏的細(xì)菌活性檢測(cè)方法對(duì)減少相關(guān)疾病發(fā)生，維護(hù)人類的健康至關(guān)重要。

細(xì)菌或真菌的活性檢測(cè)的傳統(tǒng)方法是分離和選擇性培養(yǎng)，有平板計(jì)數(shù)法、濾膜法、多管發(fā)酵法等，這些方法不需要大型儀器，可以檢測(cè)活細(xì)菌或真菌，其缺點(diǎn)是耗時(shí)長、效率低，不能滿足水質(zhì)監(jiān)測(cè)、食品衛(wèi)生、臨床診斷所需的快速檢測(cè)的要求。常見細(xì)菌或真菌的活性快速檢測(cè)方法是基于pcr技術(shù)的研究。普通pcr難以區(qū)分活菌與死菌，但可通過核酸交聯(lián)劑透過細(xì)胞膜與死菌dna結(jié)合，抑制死菌dna擴(kuò)增；或擴(kuò)增僅存在于活菌中的mrna，達(dá)到檢測(cè)活菌的目的。但是由于pcr對(duì)很少的dna即可有很好的擴(kuò)增效果，這種方法難以將死菌的dna或mrna完全去除，導(dǎo)致假陽性很高，無法滿足實(shí)際需要。因此，開發(fā)更快速且更準(zhǔn)確的細(xì)菌活性檢測(cè)方法，在環(huán)境、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、食品等多個(gè)領(lǐng)域具有重要的用途。

為了開發(fā)快速準(zhǔn)確的細(xì)菌或真菌的活性檢測(cè)方法，本發(fā)明利用分子印跡聚合物(molecularlyimprintedpolymers，mips)，目前，已有不少研究者對(duì)細(xì)菌或真菌的mips進(jìn)行研究，在細(xì)菌mips中，部分研究者以細(xì)菌表面蛋白為模板制備mips，例如khan等人在單壁碳納米管上，以金黃色葡萄球菌外層有代表性的蛋白a為模板，通過循環(huán)伏安法使3-氨基酚發(fā)生電聚合制備mips，在有牛血清白蛋白干擾的情況下，mips對(duì)模板仍有良好的選擇性(khanmsr,moreiraftc,riujetal.plasticantibodyfortheelectrochemicaldetectionofbacterialsurfaceproteins.sensoractuatb-chem,2016,233:697-704.)。jiang等人在磁性納米顆粒表面，以革蘭陰性菌的信號(hào)分子ahls為模板，通過表面印跡制備了mips，可對(duì)細(xì)菌進(jìn)行間接檢測(cè)(jiangh,jiangd,shaojetal.magneticmolecularlyimprintedpolymernanoparticlesbasedelectrochemicalsensorforthemeasurementofgram-negativebacterialquorumsignalingmolecules(n-acyl-homoserine-lactones).biosensbioelectron,2016,75:411-419.)。idil等人以整個(gè)大腸桿菌為模板，以n-甲基丙烯酰-l-組氨酸、2-甲基丙烯酸羥乙酯為功能單體，以乙二醇二甲基丙烯酸為交聯(lián)劑，用紫外光進(jìn)行引發(fā)，制備大腸桿菌mips，可特異性吸附模板大腸桿菌。對(duì)大腸桿菌的檢出限為70cfu/ml，檢測(cè)范圍為1.0×10²-1.0×10⁷cfu/ml。該方法用于果汁和河水中加標(biāo)大腸桿菌的檢測(cè)，回收率為81-97％(idiln,hedstromm,denizliaetal.wholecellbasedmicrocontactimprintedcapacitivebiosensorforthedetectionofescherichiacoli.biosensbioelectron,2017,87:807-815.)。roy等人以整個(gè)大腸桿菌為模板，以n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺為功能單體制備大腸桿菌mips。與亞鐵/鐵氰化物氧化還原探針連用，可實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)，且與大腸桿菌在10-109cfu/ml范圍線性相關(guān)，檢出限為10cfu/ml。除了能檢測(cè)外，該材料還可從水樣中捕獲超過98％的大腸桿菌。最后該材料還可以通過光熱在5分鐘內(nèi)殺死10⁵cfu/ml大腸桿菌(roye,patras,tiwariaetal.singlecellimprintingonthesurfaceofag-znobimetallicnanoparticlemodifiedgrapheneoxidesheetsfortargeteddetection,removalandphotothermalkillingofe.coli.biosensbioelectron,2017,89(pt1):620-626.)。以上研究均表明細(xì)菌mips可特異性結(jié)合并檢測(cè)靶細(xì)菌，但以上工作均未研究mips是否可以測(cè)定細(xì)菌或真菌活性，而且上述檢測(cè)細(xì)菌或真菌的mips的操作較為復(fù)雜。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決以上問題，本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)菌或真菌的活性快速檢測(cè)方法，能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出細(xì)菌或真菌樣品中細(xì)菌或真菌的活性。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

細(xì)菌或真菌的活性快速檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1)制備靶細(xì)胞的熒光分子印跡聚合物：

首先稱取多巴胺和丹磺酰多巴胺，配制多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液；然后將多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液、靶細(xì)胞和載體混合均勻，以靶細(xì)胞為模板、丹磺酰多巴胺為熒光功能單體、多巴胺為功能單體，在載體表面進(jìn)行聚合反應(yīng)得到靶細(xì)胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體；最后利用洗脫劑將靶細(xì)胞從靶細(xì)胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體上洗脫下來，得到靶細(xì)胞的熒光分子印跡聚合物；

2)檢測(cè)細(xì)菌活性：

向熒光分子印跡聚合物中加入細(xì)菌或真菌樣品后即刻測(cè)定熒光值為i0，待細(xì)菌或真菌樣品中的細(xì)菌或真菌與熒光分子印跡聚合物結(jié)合完全后，測(cè)定熒光值為i，i0/i-1表示熒光變化水平，通過熒光變化水平確定樣品中是否含有靶細(xì)菌或靶真菌以及該靶細(xì)菌或靶真菌的含量。

作為優(yōu)選方案，所述步驟1)中載體為經(jīng)聚多巴胺修飾后得到的多巴胺-載體復(fù)合體，所述多巴胺-載體復(fù)合體是通過將多巴胺和載體材料混合，并在過硫酸銨催化作用下，多巴胺在載體材料表面發(fā)生自聚合反應(yīng)而制得。

作為優(yōu)選方案，所述載體材料為納米微球、微米微球或多孔板。

作為優(yōu)選方案，所述靶細(xì)胞為靶細(xì)菌或靶真菌，所述靶細(xì)菌為革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌，所述靶細(xì)菌的濃度為10⁴～10⁶cfu/ml。

作為優(yōu)選方案，所述革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌，所述革蘭氏陰性菌為大腸桿菌或蠟樣芽孢桿菌；所述靶真菌為酵母菌。

作為優(yōu)選方案，所述多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液中包括多巴胺、丹磺酰多巴胺和催化劑。

作為優(yōu)選方案，所述催化劑為過硫酸銨。

作為優(yōu)選方案，所述多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液中多巴胺、丹磺酰多巴胺、過硫酸銨的摩爾比為4:1:1。

作為優(yōu)選方案，所述洗脫劑為去離子水。

本發(fā)明制得的熒光分子印跡聚合物在檢測(cè)水樣中細(xì)菌活性及其含量的應(yīng)用。具體方法為，將以熒光分子印跡聚合物為敏感膜制成熒光分子印跡聚合物傳感器(fmips傳感器)，將fmips傳感器投置于待檢測(cè)的水樣中，通過fmips傳感器的熒光值變化得出水樣中的靶細(xì)菌和靶真菌的含量。

本發(fā)明的細(xì)菌或真菌的活性快速檢測(cè)方法的原理是：

分子印跡聚合物(molecularlyimprintedpolymers，mips)是化學(xué)合成的高分子聚合物，通過特定的空間結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵(包括共價(jià)鍵、離子鍵、氫鍵等)特異性識(shí)別和結(jié)合靶分子，其吸附特異性與天然抗體類似，但耐受有機(jī)溶劑、離子、酸堿、高溫和高壓。其中含熒光的mips，又稱熒光分子印跡聚合物(fluorescentmolecularlyimprintedpolymers,fmips)，不僅可以特異性結(jié)合模板分子，同時(shí)模板分子的結(jié)合還可以導(dǎo)致熒光mip發(fā)生熒光信號(hào)的改變(如熒光波長改變，或者熒光強(qiáng)度改變)，根據(jù)熒光信號(hào)的改變，即可測(cè)定與fmips特異性結(jié)合的模板分子的含量。

結(jié)合圖1所示，本發(fā)明以靶細(xì)胞為模板、丹磺酰多巴胺作為熒光功能單體，多巴胺作為功能單體，在載體表面制備靶細(xì)胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體，然后再從復(fù)合體上將靶細(xì)胞洗脫，即得到可特異性吸附靶細(xì)胞的熒光分子印跡聚合物(fmips)。

當(dāng)細(xì)菌樣品中活靶細(xì)胞與fmips結(jié)合時(shí)，可導(dǎo)致fmips的熒光減弱，通過比較加樣前后的熒光改變，即可快速測(cè)定樣品中是否存在活細(xì)菌，并初步確定活細(xì)菌的含量。

本發(fā)明中采用的丹磺酰多巴胺的制備方法參閱中國發(fā)明專利(授權(quán)公告號(hào)cn103992252b授權(quán)公告日2016.06.22)公開的一種多巴胺衍生物及分子印跡聚合物制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1，本發(fā)明通過使用丹磺酰多巴胺和多巴胺在載體表面進(jìn)行聚合反應(yīng)制備得到靶細(xì)胞的fmips，由于丹磺酰多巴胺和多巴胺在水相條件下即可進(jìn)行聚合反應(yīng)，在水相條件下保證了靶細(xì)胞的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，而且聚多巴胺可為細(xì)菌印跡提供豐富的羥基，提高了fmips的印跡效果。

2，靶細(xì)胞的fmips對(duì)靶細(xì)胞具有特異性識(shí)別能力。fmips集特異性吸附和熒光檢測(cè)于一體，不僅可以特異性吸附靶細(xì)胞，還可以根據(jù)熒光的改變，直接快速測(cè)定其結(jié)合的靶細(xì)胞含量。

3，利用靶細(xì)胞的fmips還可有效地區(qū)分活細(xì)菌和死細(xì)菌，可直接測(cè)定水中的靶細(xì)胞，并且耐受水中其他細(xì)菌、死的同類細(xì)菌、離子、有機(jī)物的干擾，適用于多種環(huán)境條件。

附圖說明

圖1為本發(fā)明細(xì)菌或真菌的活性快速檢測(cè)方法的流程圖；

圖2a為使用經(jīng)聚多巴胺修飾的多巴胺-載體復(fù)合體和不使用聚多巴胺修飾的多巴胺-載體復(fù)合體，所制備的fmips吸附靶細(xì)菌前后的熒光變化水平圖；

圖2b為多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液的過硫酸銨、多巴胺和丹磺酰多巴胺配比優(yōu)化圖；

圖2c為使用不同洗脫劑所制備的fmips吸附靶細(xì)菌后的熒光變化水平圖；

圖2d為使用不同的靶細(xì)菌濃度制備的fmips吸附靶細(xì)菌后的熒光變化水平圖；

圖3a為實(shí)施例1制得的e.coli-fmips-ⅰ的電鏡掃描圖；

圖3b為對(duì)比例1制得的fnip的電鏡掃描圖；

圖3c為fmips膜的厚度的測(cè)量；

圖3d為聚多巴胺修飾多孔板得到的多巴胺-載體復(fù)合體上的單層多巴胺膜(pda)厚度的測(cè)量；

圖3e為單層多巴胺膜(pda)、e.coli-fmips-ⅰ和fnip膜的熱重曲線；

圖4a為e.coli-fmips-ⅰ對(duì)e.coli285的吸附等溫曲線圖；

圖4b為e.coli-fmips-ⅰ吸附動(dòng)力學(xué)曲線；

圖4c為e.coli-fmips-ⅰ吸附e.coli285時(shí)熒光隨時(shí)間變化趨勢(shì)線圖；

圖5a為e.coli285-fmip吸附不同大腸桿菌后的熒光變化水平；

圖5b為e.coli285-fmips吸附不同的細(xì)菌和真菌后的熒光變化水平；

圖5c為以不同種的大腸桿菌為模板制備的各種fmips，結(jié)合不同大腸桿菌后的熒光變化值；

圖5d為分別以不同的細(xì)菌和真菌為模板所制備的fmips，吸附不同靶細(xì)菌和靶真菌后的熒光變化水平；

圖6a為e.coli285-fmip對(duì)活菌、高壓滅活菌、酒精滅活菌的熒光響應(yīng)；

圖6b為e.coli285-fmips分別吸附不同起始滴度(約50～3000cfu/ml)的e.coli285菌液的熒光變化標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖6c為e.coli285-fmips分別吸附不同起始滴度(約50～3000cfu/ml)的滅活e.coli285菌液的熒光變化標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖中各部件標(biāo)號(hào)如下：靶細(xì)胞(大腸桿菌)1、多巴胺2、丹磺酰多巴胺3、96孔酶標(biāo)板4、靶細(xì)胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體5、大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物6、加入大腸桿菌后的熒光分子印跡聚合物7；其中，熒光值的大小為6>7。

具體實(shí)施方式

為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在耗時(shí)長、效率低，無法準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)菌活性的問題，本發(fā)明提供一種細(xì)菌或真菌的活性快速檢測(cè)方法，本方法從制備靶細(xì)胞的熒光分子印跡聚合物為設(shè)計(jì)思路的出發(fā)，通過以靶細(xì)胞為模板、丹磺酰多巴胺作為熒光功能單體，多巴胺作為功能單體，在載體表面發(fā)生聚合反應(yīng)，制備靶細(xì)胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體材料復(fù)合體，再從復(fù)合體上將靶細(xì)胞洗脫，得到可特異性吸附靶細(xì)胞的熒光分子印跡聚合物(fmips)來達(dá)到上述設(shè)計(jì)目的。以下通過具體的實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明的病毒活性快速檢測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)地說明。

實(shí)施例1制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅰ

制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅰ的方法，包括步驟：

1)試劑的配制：

多巴胺溶液?。哼^硫酸銨與多巴胺以2:1的摩爾比溶于10mmol/ltris-hcl緩沖溶液(tris-hcl緩沖溶液ph＝8)；

多巴胺溶液ⅱ：多巴胺溶于10mmol/ltris-hcl緩沖溶液(tris-hcl緩沖溶液ph＝8)；

多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液：多巴胺：丹磺酰多巴胺：過硫酸銨摩爾比＝4：1：1的摩爾比溶于10mmol/ltris-hcl緩沖溶液(tris-hcl緩沖溶液ph＝8)；

載體材料：以96孔酶標(biāo)板作為載體材料；

靶細(xì)胞：10⁴～10⁶cfu/ml的大腸桿菌菌液，大腸桿菌采用e.coli285；

洗脫液：去離子水；

2)多巴胺-載體復(fù)合體的制備(聚多巴胺修飾載體材料)：

向在96孔酶標(biāo)板中的每孔加300μl多巴胺溶液ⅰ，置于37℃的空氣中96孔酶標(biāo)板與多巴胺發(fā)生自聚合反應(yīng)，反應(yīng)24h后將孔中多巴胺溶液倒去，得到多巴胺-載體復(fù)合體；

3)大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體的制備：

向多巴胺-載體復(fù)合體中加入多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液和靶細(xì)胞(大腸桿菌)，置于搖床中(溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為150rpm)緩慢振搖72h后倒去孔中的液體，即得大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體；

4)洗脫靶細(xì)胞：

用去離子水反復(fù)洗滌大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體，將大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體中的大腸桿菌洗脫下來，每次洗滌30min，共洗滌6次，得到大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅰ，大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅰ以下均采用簡(jiǎn)稱e.coli-fmips-ⅰ。

實(shí)施例2制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅱ

實(shí)施例2的制備方法與是實(shí)施例相比，區(qū)別在于：實(shí)施例2不進(jìn)行實(shí)施例1中的步驟2)，即實(shí)施例2不采用經(jīng)聚多巴胺修飾的多巴胺-載體復(fù)合體作為載體，而是直接將多巴胺，丹磺酰多巴胺，大腸桿菌在載體材料上聚合。具體過程如下：

1)大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體的制備：向96孔酶標(biāo)板中加入多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液和靶細(xì)胞(大腸桿菌)，置于搖床中(溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為150rpm)緩慢振搖72h后倒去孔中的液體，即得大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體；；

2)洗脫靶細(xì)胞：用洗脫劑反復(fù)洗滌大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體，將大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體中的大腸桿菌洗脫下來，每次洗滌30min，共洗滌6次，得到大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅱ。

實(shí)施例3制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅲ

大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅲ的制備方法與實(shí)施例1相同，不同之處在于：本實(shí)施例將實(shí)施例1步驟2)中的多巴胺溶液ⅰ改為多巴胺溶液ⅱ，多巴胺溶液ⅰ與多巴胺溶液ⅱ的區(qū)別在于過硫酸銨的是否添加。本實(shí)施例制備的大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅲ的方法在此不再贅述。

實(shí)施例4制備蠟樣芽孢桿菌的熒光分子印跡聚合物

蠟樣芽孢桿菌的熒光分子印跡聚合物的制備方法與實(shí)施例1相同，不同之處在于：本實(shí)施例將實(shí)施例1步驟3)中的靶細(xì)胞改為蠟樣芽孢桿菌，本實(shí)施例制得的蠟樣芽孢桿菌的熒光分子印跡聚合物以下均采用簡(jiǎn)稱蠟樣芽孢桿菌-fmips。

實(shí)施例5制備金黃色葡萄球菌的熒光分子印跡聚合物

金黃色葡萄球菌的熒光分子印跡聚合物的制備方法與實(shí)施例1相同，不同之處在于：本實(shí)施例將實(shí)施例1步驟3)中的靶細(xì)胞改為金黃色葡萄球菌，本實(shí)施例制得的金黃色葡萄球菌的熒光分子印跡聚合物以下均采用簡(jiǎn)稱金黃色葡萄球菌-fmips。

實(shí)施例6制備酵母菌的熒光分子印跡聚合物

酵母菌的熒光分子印跡聚合物的制備方法與實(shí)施例1相同，不同之處在于：本實(shí)施例將實(shí)施例1步驟3)中的靶細(xì)胞改為酵母菌，本實(shí)施例制得的酵母菌的熒光分子印跡聚合物以下均采用簡(jiǎn)稱酵母菌-fmips。

實(shí)施例7制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅳ

1)試劑的配制：

多巴胺溶液?。哼^硫酸銨與多巴胺以2:1的摩爾比溶于10mmol/ltris-hcl緩沖溶液(tris-hcl緩沖溶液ph＝8)；

多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液：多巴胺：丹磺酰多巴胺：過硫酸銨摩爾比＝4：1：1的摩爾比溶于10mmol/ltris-hcl緩沖溶液(tris-hcl緩沖溶液ph＝8)；

載體材料：以150mg/ml硅膠微球?yàn)檩d體材料；

靶細(xì)胞：10⁴～10⁶cfu/ml的大腸桿菌菌液，大腸桿菌采用e.coli285；

洗脫液：去離子水

2)多巴胺-載體復(fù)合體的制備：

將150mg/ml硅膠微球與多巴胺溶液ⅰ在37℃攪拌混合10小時(shí)，硅膠微球與多巴胺發(fā)生自聚合反應(yīng)，10小時(shí)后取出硅膠微球，得到多巴胺-載體復(fù)合體；

3)大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體的制備：

向多巴胺-載體復(fù)合體中加入多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液和靶細(xì)胞(大腸桿菌e.coli285)，置于搖床中(溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為150rpm)緩慢攪拌10小時(shí)后取出硅膠微球，即得大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體；

4)洗脫靶細(xì)胞：

用洗脫劑反復(fù)洗滌大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體，將大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體中的大腸桿菌洗脫下來，每次洗滌30min，共洗滌6次，得到大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅳ。

實(shí)施例8制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅴ

大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅴ制備方法與實(shí)施例7相同，不同之處在于：本實(shí)施例將實(shí)施例5中的硅膠微球載體改為1mg/ml四氧化三鐵納米微球。

實(shí)施例9空白印跡聚合物(nip)的制備

分別制備實(shí)施例1～8的對(duì)比例，分別為對(duì)比例1、對(duì)比例2、對(duì)比例3、對(duì)比例4、對(duì)比例5、對(duì)比例6、對(duì)比例7和對(duì)比例8。對(duì)比例1、對(duì)比例2、對(duì)比例3、對(duì)比例4、對(duì)比例5和對(duì)比例6、對(duì)比例7和對(duì)比例8與對(duì)應(yīng)的實(shí)施例的制備方法相同，區(qū)別在于：不添加靶細(xì)胞。以對(duì)比例1為例，其他在此不在贅述。

對(duì)比例1的制備方法與實(shí)施例1的制備方法相同，區(qū)別在于：步驟3)中不添加靶細(xì)胞(大腸桿菌)。對(duì)比例1～8制得的空白印跡聚合物以下以及說明說附圖中均使用簡(jiǎn)稱fnip。

實(shí)施例10反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化試驗(yàn)

向?qū)嵤├?～8中制備的細(xì)菌或真菌的熒光分子印跡聚合物(fmips)以及各實(shí)施例對(duì)應(yīng)的空白印跡聚合物(fnips)中，分別加入300μlpbs緩沖溶液，測(cè)其熒光值作為i0，倒掉pbs緩沖溶液后，加入模板菌液或細(xì)胞液300μl后測(cè)其熒光值，作為i，用i0/i-1表示熒光變化程度。每個(gè)濃度平行測(cè)定3次取平均值，結(jié)果分別見圖2a、圖2b、圖2c、圖2d。以下分別對(duì)圖2a、圖2b、圖2c和圖2d作詳細(xì)的說明。

圖2a為實(shí)施例1和實(shí)施例2的熒光變化水平對(duì)比圖，即使用聚多巴胺修飾的載體材料和不使用聚多巴胺的載體材料所制備的fmips吸附靶細(xì)胞前后的熒光變化水平圖；實(shí)施例1中使用載體為聚多巴胺修飾的多巴胺-載體復(fù)合體，實(shí)施例2未對(duì)載體進(jìn)行修飾；分別測(cè)定fmips吸附靶細(xì)胞前后的熒光變化水平。由圖2a可見，修飾在載體上的聚多巴胺膜(pda)的孔上再合成mips，熒光變化效果優(yōu)于未修飾聚多巴胺膜的。其原理是：聚多巴胺膜能提供大量的氨基和兒茶酚基，可與細(xì)菌壁外層的功能基團(tuán)發(fā)生作用，增加了與細(xì)菌的結(jié)合能力，從而使熒光變化明顯。

圖2b為多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液的過硫酸銨、多巴胺和丹磺酰多巴胺配比優(yōu)化圖；通過測(cè)定過硫酸銨、多巴胺和丹磺酰多巴胺，在不同的摩爾比之下制備的fmip和fnip吸附靶細(xì)菌前后的熒光變化水平，選擇最佳的配比。圖2b可以看出，使用了過硫酸銨的mip熒光變化量提高了兩倍以上，可知催化劑過硫酸銨的使用是成功制備抗病毒mip的前提。多巴胺：丹磺酰多巴胺與過硫酸銨的比例選為4:1:1時(shí)，fmip的熒光變化量最大，表明該條件下所制備的fmips吸附性能最佳。

圖2c為使用不同洗脫液，所制備的fmips吸附靶細(xì)胞后的熒光變化水平圖；由圖2c可以看出，以去離子水為洗脫液的效果明顯優(yōu)于3％乙酸與1mol/lnacl的混合液。其原理是在低滲環(huán)境中，細(xì)菌可因吸水過度而膨脹死亡。本實(shí)驗(yàn)中以去離子水為洗脫液，提供低滲環(huán)境，可使大腸桿菌發(fā)生死亡而洗脫下來。

圖2d為使用不同的靶細(xì)胞濃度時(shí)，所制備的fmips吸附靶細(xì)胞后的熒光變化水平圖；由圖2d可以看出，當(dāng)e.coli285菌懸液濃度為10⁵cfu/ml時(shí)，熒光變化最為明顯，在小于10⁵cfu/ml時(shí)，隨著模板滴度增加，能與模板結(jié)合的功能單體數(shù)量也增加，致使結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量增加，熒光變化增加。

實(shí)施例11理化性質(zhì)分析試驗(yàn)

圖3a為實(shí)施例1制得的e.coli-fmips-ⅰ的電鏡掃描圖；

圖3b為對(duì)比例1制得的fnip的電鏡掃描圖；

由圖3a和圖3b可看出，e.coli-fmips-ⅰ與fnip均為膜狀物，圖3a可見，大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復(fù)合體在洗脫完靶細(xì)胞后存在形態(tài)、大小不一的孔穴，這些孔穴為大腸桿菌去除后留下的三維孔穴結(jié)構(gòu)，形狀有圓形、橢圓形，為大腸桿菌的橫斷面、不同側(cè)面留下的印跡?？籽ㄖ睆綖?.8～1.7μm，這與大腸桿菌的大小一致。圖3b的fnips膜并沒有看出明顯的孔穴。

在以硅膠微球?yàn)檩d體材料，制備多巴胺-載體復(fù)合體，對(duì)多巴胺-載體復(fù)合體上的單層聚多巴胺膜(pda)、大腸桿菌285-fmips和fnips膜用元素分析儀對(duì)n、c、h元素含量進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。從表1可以看出，fmips、fnips膜中n、c元素含量相比單層pda膜明顯增加，說明成功地在pda單層膜上制備了含更多n元素的丹磺酰多巴胺和多巴胺的fmips、fnips。

表1elementcompositionofpda,fmips,fnipsmembrane

圖3c為fmips膜的厚度的測(cè)量；

圖3d為修飾在載體上的單層多巴胺膜(pda)厚度的測(cè)量；

由圖3c和圖3d可以看出，fmips膜的厚度并不均一，范圍從16.0～48.0μm，而且明顯厚于單層多巴胺膜(約為2.8μm)。

圖3e為單層多巴胺膜(pda)、e.coli-fmips-ⅰ和fnip膜的熱重曲線；不同物質(zhì)會(huì)隨著溫度不斷升高而發(fā)生分解，導(dǎo)致重量下降，通過熱重分析可判斷形成的薄膜量。多巴胺在248℃開始分解，而交聯(lián)后形成的聚多巴胺比較耐熱，在400℃開始分解。從圖3e中可以看出，從425℃開始三條線的重量有明顯的下降，該溫度正是聚多巴胺開始分解的溫度，說明三種膜均有聚多巴胺。至700℃單層pda膜失重約0.4％，fmip膜約失重2％，fnip膜約失重1.3％，說明fmip和fnip膜明顯厚于單層pda膜，成功在單層pda膜上制備了fmip。

實(shí)施例12e.coli-fmips-ⅰ對(duì)e.coli285的吸附特性

如圖4a，e.coli-fmips-ⅰ對(duì)e.coli285的吸附等溫曲線圖；配制不同濃度的e.coli285菌懸液，分別加入到e.coli-fmips-ⅰ和對(duì)應(yīng)的fnip中，吸附平衡后，用平板涂布法測(cè)定上清液中細(xì)菌的滴度。以吸附量adsorption(cfu/cm²)為縱坐標(biāo)，菌液起始滴度c0(cfu/ml)為橫坐標(biāo)，繪制吸附等溫線。從圖4a可見當(dāng)起始菌液滴度小于800cfu/ml時(shí)，吸附容量隨著菌液的濃度增加而增加，大于800cfu/ml時(shí)，曲線趨于平緩，說明此時(shí)fmip上的識(shí)別位點(diǎn)均已與大腸桿菌模板結(jié)合，達(dá)到吸附飽和狀態(tài)。

圖4b為e.coli-fmips-ⅰ吸附動(dòng)力學(xué)曲線；將100cfu/ml的e.coli285加入到fmip和fnip中，分別在0.5h、1h、2h、3h、6h、9h、12h時(shí)間點(diǎn)用平板涂布法測(cè)上清菌液滴度，同時(shí)測(cè)其熒光變化。以吸附量adsorption(cfu/cm2)為縱坐標(biāo)，時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線；圖4b顯示，出在前1個(gè)小時(shí)，隨時(shí)間增加，吸附量明顯增加，吸附速率較快，吸附在1h后達(dá)到平衡。

圖4c為e.coli-fmips-ⅰ吸附e.coli285時(shí)熒光隨時(shí)間變化趨勢(shì)線圖；將100cfu/ml的e.coli285加入到fmip和fnip中，分別在0.5h、1h、2h、3h、6h、9h、12h時(shí)間點(diǎn)測(cè)定fmips和fnips的熒光；圖4c顯示，fmips和fnips的熒光，與吸附率對(duì)應(yīng)，均在吸附1h后達(dá)到平衡。顯示熒光變化量可以準(zhǔn)確反映靶細(xì)胞的吸附率。

實(shí)施例13靶細(xì)胞fmips的吸附特異性

在大腸桿菌285(e.coli285)為模板所制備的fmips中，分別加入e.coli285，e.colitg1，e.colibl21，吸附2h后測(cè)定熒光變化量，圖5a顯示，e.coli285-fmips對(duì)其它大腸桿菌菌株也有一定的熒光響應(yīng)，但對(duì)e.coli285的響應(yīng)要略優(yōu)于其它菌株。不同大腸桿菌菌株可能存在血清型、基因型的差別，但其整體形態(tài)、結(jié)構(gòu)、大小差別不大，因此e.coli285-fmips對(duì)其它大腸桿菌菌株的響應(yīng)與e.coli285差別不大。

在e.coli285為模板所制備的fmips中，分別加入e.coli285,金黃色葡萄球菌(s.aureus)、蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)和釀酒酵母菌(saccharomycetes)，圖5bfmips對(duì)e.coli285的結(jié)合量最大，金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和真菌能引起e.coli285-fmips一定的熒光變化，但變化程度沒有e.coli285大。金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌屬于革蘭陽性菌，其最外層的磷壁酸，酵母菌最外層的甘露聚糖，都有羥基可與多巴胺和丹磺酰多巴胺上的氨基反應(yīng)，因此會(huì)引起e.coli285-fmips的熒光發(fā)生一定的變化。但熒光變化水平與e.coli285比較，有明顯差異，表面fmips可以區(qū)分屬不同的微生物。

分別以大腸桿菌的tg1和bl21、用同樣的方法制備fmips，比較各種大腸桿菌fmips對(duì)目標(biāo)菌和其它菌的選擇性。從圖4c可以看出e.colitg1-fmips和e.colibl21-fmips對(duì)目標(biāo)菌和其它大腸桿菌都有一定的吸附，該結(jié)果與e.coli285-fmips一致，說明該mips的制備方法可用于大腸桿菌種這一類細(xì)菌的檢測(cè)。

分別以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、釀酒酵母菌為模板，比較各種不同的微生物fmips對(duì)不同微生物的識(shí)別能力。從圖5d可以看出大腸桿菌fmips、金黃色葡萄球菌fmips、蠟樣芽孢桿菌fmips、釀酒酵母菌fmips，均對(duì)模板微生物有較好的響應(yīng)，而對(duì)其它微生物的相應(yīng)較弱。這主要是因?yàn)榧?xì)菌及真菌因?yàn)樾螤?、大小和外層結(jié)構(gòu)不同，對(duì)不同的fmips的識(shí)別能力有明顯區(qū)別。表明fmips具有屬特異性識(shí)別能力。

實(shí)施例14fmip檢測(cè)細(xì)菌活性(以大腸桿菌為例)

為評(píng)價(jià)大腸桿菌285-fmips在檢測(cè)過程中是否能區(qū)分活菌與死菌，分別在fmips、fnips中加入大腸桿菌285活菌、高壓滅活菌、酒精滅活菌，待吸附平衡后，測(cè)定熒光變化i0/i-1。圖6a顯示fmips可以特異性識(shí)別活菌，對(duì)不同方法滅活的靶細(xì)菌均可以有效識(shí)別。

用大腸桿菌285-fmips分別吸附不同起始滴度(約50～3000cfu/ml)的大腸桿菌285菌液，待吸附平衡后，測(cè)其熒光變化i0/i-1，以熒光變化i0/i-1為縱坐標(biāo)，菌液起始滴度c0為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖6b可以看出在45～840cfu/ml的范圍內(nèi)，熒光變化隨菌液滴度的增加而增加，線性方程為y＝0.0005x+0.2891，r2＝0.8973，其lod為15cfu/ml。

用大腸桿菌285-fmips分別吸附不同起始滴度(約50～3000cfu/ml)的滅活大腸桿菌285菌液，待吸附平衡后，測(cè)其熒光變化i0/i-1，以熒光變化i0/i-1為縱坐標(biāo)，菌液起始滴度c0為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖6c可以看出該散點(diǎn)圖沒有明顯的線性規(guī)律，fmips僅對(duì)活菌具有線性，對(duì)滅活菌的檢測(cè)無線性。該方法可進(jìn)行細(xì)菌活性檢測(cè)。

將自來水高壓滅菌后加入不同濃度的活菌，同時(shí)加入高壓滅活菌為干擾，用fmips進(jìn)行吸附后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出目標(biāo)菌液滴度，結(jié)果如表2。經(jīng)t檢驗(yàn)fmips傳感器測(cè)得細(xì)菌含量與平板涂布法之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尚不能認(rèn)為fmips傳感器檢測(cè)大腸桿菌的結(jié)果與平板涂布法有差異，亦可證明滅活菌對(duì)于活菌的檢測(cè)幾乎沒有干擾。加標(biāo)回收率為93.50％～102.20％。fmips可用于實(shí)際樣品中細(xì)菌活性檢測(cè)，不受樣品中所存在的滅活細(xì)菌的影響。

表2實(shí)際水樣檢測(cè)結(jié)果

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。