本發(fā)明涉及一種細(xì)胞生物學(xué)染色方法，特別涉及一種新的活細(xì)胞線粒體數(shù)量染色檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

線粒體（mitochondrion）是細(xì)胞中制造能量的細(xì)胞器，被稱為細(xì)胞的“powerhouse（發(fā)電廠）”。除了為細(xì)胞供給能量外，線粒體還參與諸如細(xì)胞分化、遺傳體系、信息傳遞和細(xì)胞凋亡等過程。

細(xì)胞內(nèi)含有線粒體的數(shù)目可以從幾百個到數(shù)千個不等，與細(xì)胞生理功能及生理狀態(tài)有關(guān)。線粒體對各種內(nèi)外損傷較為敏感，在細(xì)胞損傷時線粒體數(shù)量的變化是最常見的改變之一。例如生理狀態(tài)下皮膚細(xì)胞的新陳代謝離不開正常發(fā)揮功能的線粒體；在病理狀態(tài)下線粒體數(shù)量的增多是對慢性細(xì)胞損傷的適應(yīng)性反應(yīng)等。

目前檢測線粒體數(shù)量采用的共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀分析、鐵蘇木精染色和健那綠染色等方法存在一定的不足。共聚焦顯微鏡檢測線粒體需要先準(zhǔn)備良好的樣品，然后在通過顯示單個細(xì)胞內(nèi)部精確的三維圖像，通過對三維圖像技術(shù)觀察得到線粒體數(shù)量的結(jié)果，這使得共聚焦顯微鏡檢測分析的操作機(jī)器繁瑣，消耗很長的時間才能完成一個樣品的檢測，而且樣品檢測觀察的數(shù)量較少，容易出現(xiàn)局部偏差，影響線粒體數(shù)量統(tǒng)計。流式細(xì)胞儀分析檢測分析的是懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列屬性，對于細(xì)胞內(nèi)部的線粒體數(shù)量分析缺乏細(xì)節(jié)分辨率，因而準(zhǔn)確度較差。

鐵蘇木素染色，是一種實(shí)驗(yàn)室染色技術(shù)，主要用于各種阿米巴和藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體和包囊的鑒定，對于細(xì)胞內(nèi)部的線粒體缺乏針對性，導(dǎo)致染色的顯示分辨率較低，不利于精確的計數(shù)統(tǒng)計。

健那綠染色，即janusgreenb染液，是專一性線粒體的活細(xì)胞染料，線粒體中細(xì)胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài))呈藍(lán)綠色，而細(xì)胞質(zhì)接近無色，以在高倍顯微鏡下觀察線粒體分布和形態(tài)。健那綠染料毒性較強(qiáng)，且試劑的價格較高。

所以，現(xiàn)有的染色方法存在諸如：操作繁瑣、儀器設(shè)備昂貴、檢測靈敏度、精確度不足等缺陷?，F(xiàn)有的研究需要對于不同的情況，需要染色觀察的目標(biāo)、待區(qū)分對象都可能隨著環(huán)境變化而變化，依然需要更多的不同的染色方法對現(xiàn)有的細(xì)胞線粒體提供更多的研究方法，為不同的研究目的提供研究基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中線粒體數(shù)量檢測方法所存在的操作繁瑣、檢測速度慢、結(jié)果準(zhǔn)確度較低等的上述不足，提供一種新的線粒體染色檢測方法。該新型技術(shù)具有簡單快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)的線粒體染色的技術(shù)方法，以與傳統(tǒng)檢測方法相互補(bǔ)充、提高檢測準(zhǔn)確度。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

一種活細(xì)胞線粒體數(shù)量染色檢測方法，包括以下步驟：

（1）原液配制：噻唑藍(lán)（mtt）溶于100ml的磷酸緩沖液（pbs，ph=7.4）中，配制成濃度為0.3-1wt%的溶液，過濾以除去細(xì)菌，避光保存。

（2）接種細(xì)胞：用培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔約2000-10000個細(xì)胞接種到96孔板中，每孔體積200-300μl?？梢赃x用其中型號的孔板，例如6、12、24、48孔板等，選用96孔板能夠培養(yǎng)更多的觀察樣本。

（3）培養(yǎng)細(xì)胞：根據(jù)細(xì)胞類型設(shè)置培養(yǎng)條件，培養(yǎng)2-8天，優(yōu)選3-5天。培養(yǎng)3-5天以后，培養(yǎng)基中細(xì)胞融合率60-80%，細(xì)胞的整體融合比例適宜，進(jìn)行染色觀察的時候更容易觀察線粒體的整體數(shù)量以及變化情況。

（4）染色：每孔加入上述噻唑藍(lán)mtt原液20-30μl，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3-5h，優(yōu)選3.5-4.5h。適宜的孵育時間使得細(xì)胞能夠更加充分吸入mtt，并使之聚集在線粒體內(nèi)部或周圍，使得后續(xù)染色觀察的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。孵育時間過長，細(xì)胞出現(xiàn)衰亡，線粒體觀察計數(shù)結(jié)果失去準(zhǔn)確性，對于研究的指導(dǎo)意義降低。

（5）觀察：小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)上清液10-50μl，加入200-300μl新鮮的培養(yǎng)液，并于高倍光學(xué)顯微鏡下觀察藍(lán)紫色顆粒數(shù)量。

本發(fā)明的活細(xì)胞線粒體數(shù)量染色檢測方法，利用mtt染色處理活細(xì)胞，首先將細(xì)胞培養(yǎng)至融合率為60-80%的適宜比例范圍內(nèi)，然后通過mtt染色顯示出藍(lán)紫色的顯著顏色。因?yàn)閙tt對于活細(xì)胞的線粒體具有顯著的針對性，顯色結(jié)果非常明顯，同時適當(dāng)比例融合的細(xì)胞個體可以方便光學(xué)顯微鏡下觀察統(tǒng)計數(shù)量。

其原理是噻唑藍(lán)，即3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍(lán)，【3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2h-tetrazoliumbromide】，簡稱mtt，具有正電荷，可以穿過細(xì)胞膜并被活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原形成不溶性的藍(lán)紫色甲臜（formazan），沉積在細(xì)胞線粒體周圍，而死細(xì)胞無此功能。

目前國內(nèi)外尚未有類似的通過噻唑藍(lán)mtt染色進(jìn)行線粒體檢測的方法，該方法的使用有助于克服傳統(tǒng)檢測方法的不足，并與傳統(tǒng)檢測方法優(yōu)勢相互補(bǔ)充、提高線粒體數(shù)量異常的檢測準(zhǔn)確度。

現(xiàn)有技術(shù)中對于mtt的應(yīng)用主要是利用線粒體琥珀酸脫氫酶能使外源性mtt還原生成水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（formazan）并沉積在活細(xì)胞中，然后利用二甲基亞砜（dmso）溶解甲瓚，測定溶液在特定波長（490nm）光吸收值。根據(jù)測得的吸光度值（od值），來判斷活細(xì)胞數(shù)量，od值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)。屬于利用mtt檢測表觀的整體細(xì)胞存活率的方法，僅僅從整體的角度去考察了溶解于dmso中的甲瓚量，表征整體的模糊的存活率，并沒有將mtt的應(yīng)用具體到專門針對于細(xì)胞內(nèi)部的線粒體數(shù)量的檢測分析。本發(fā)明將mtt的顯色特性應(yīng)用于活細(xì)胞線粒體數(shù)量染色檢測方法，為線粒體數(shù)量檢測提供了新方案，擴(kuò)寬了線粒體數(shù)量染色檢測分析的可選擇方法，具有重要的意義。

根據(jù)細(xì)胞類型設(shè)置培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)技術(shù)手段，不同的細(xì)胞系培養(yǎng)的時候可能需要應(yīng)用到不同的培養(yǎng)基、營養(yǎng)液成分，可以參考現(xiàn)有技術(shù)中細(xì)胞培養(yǎng)方法選擇適宜的培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)條件是本發(fā)明的實(shí)施的輔助因素。

其中，噻唑藍(lán)溶液在配制以后兩周內(nèi)有效。根據(jù)發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)新鮮配制的噻唑藍(lán)溶液染色檢測分析的結(jié)果最為準(zhǔn)確可靠，mtt溶液的保質(zhì)期為兩周。在配制和保存的過程中，容器注意避光保存，例如可以用鋁箔紙包住實(shí)現(xiàn)避光。通過將容器用遮光材料包裹實(shí)現(xiàn)遮光效果，避免光照對于mtt溶液的影響。

進(jìn)一步，配制噻唑藍(lán)溶液的時候用0.22μm濾膜過濾除去細(xì)菌，通過過濾使得染色的試劑純凈度高，減少雜質(zhì)、細(xì)菌等因素對于染色以后的樣品觀察的影響，同時0.22μm濾膜容易獲得，價格低廉，并且對于細(xì)菌的過濾效果較好。

進(jìn)一步，配制好的噻唑藍(lán)溶液放置在0-8℃溫度下保存，最好是放置在4℃環(huán)境保存。噻唑藍(lán)溶液在低溫的環(huán)境下進(jìn)行保存有利于減少雜質(zhì)沉淀的產(chǎn)生，也可以抑制細(xì)菌的繁殖，提高試劑的顯色效率。

進(jìn)一步，步驟2中接種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的時候，根據(jù)細(xì)胞的類型選擇適宜的細(xì)胞培養(yǎng)液。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

1.本發(fā)明方法利用mtt進(jìn)行線粒體染色計數(shù)的方法，和現(xiàn)有的多種染色方法互為補(bǔ)充，能夠更好的為細(xì)胞科學(xué)研究工作提供輔助分析方法，減少因?yàn)榫€粒體染色研究方法對于特定情況不能很好適應(yīng)導(dǎo)致的研究受阻問題。

2.本發(fā)明方法主要應(yīng)用于科學(xué)研究領(lǐng)域，有助于為線粒體疾病的相關(guān)研究（包括診斷和慢病預(yù)后分析管理等）提供客觀依據(jù)，相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)應(yīng)用將有利于降低社會醫(yī)療成本。

3.本發(fā)明方法對于活細(xì)胞線粒體數(shù)量染色檢測方法主要可以應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，包括基礎(chǔ)研究和臨床研究。預(yù)計每年使用該染色檢測方法約200萬次，在解決傳統(tǒng)染色方法不足的同時，可為生產(chǎn)企業(yè)帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

附圖說明：

圖1是高倍光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)部的線粒體被mtt染色，顯示出深色（藍(lán)色）。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合試驗(yàn)例及具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1]

活細(xì)胞線粒體數(shù)量染色檢測

對成纖維細(xì)胞進(jìn)行染色檢測分析線粒體數(shù)量，具體流程如下。

1、原液配制：噻唑藍(lán)mtt0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液（pbs，ph=7.4）中，用0.22μm濾膜過濾以除去細(xì)菌，放4℃避光保存（兩周內(nèi)有效）。

2、接種細(xì)胞：將成纖維細(xì)胞用培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔約2000-10000個細(xì)胞接種到96孔板中，每孔體積200μl。

3、培養(yǎng)細(xì)胞：根據(jù)細(xì)胞類型設(shè)置培養(yǎng)條件，培養(yǎng)4天，細(xì)胞融合率60-80%。

4、染色：每孔加入上述噻唑藍(lán)mtt原液20μl，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4h。

5、觀察：小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入200μl新鮮的培養(yǎng)液，并于高倍光學(xué)顯微鏡下觀察藍(lán)紫色顆粒數(shù)量。

結(jié)果如圖1所示，圖中深色顆粒的數(shù)量提示線粒體的數(shù)量（彩色照片顯示為藍(lán)紫色顆粒）。經(jīng)過顯微鏡照片計數(shù)統(tǒng)計，該組成纖維細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量為600-2000相對顆粒。

[實(shí)施例2]

活細(xì)胞線粒體數(shù)量染色檢測

對成纖維細(xì)胞進(jìn)行染色檢測分析線粒體數(shù)量，具體流程如下。

1、原液配制：噻唑藍(lán)mtt0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液（pbs，ph=7.4）中，用0.22μm濾膜過濾以除去細(xì)菌，放3℃避光保存。在配制和保存的過程中，容器用鋁箔紙包住避光。

2、接種細(xì)胞：將成纖維細(xì)胞用培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔約2000-10000個細(xì)胞接種到96孔板中，每孔體積200μl。

3、培養(yǎng)細(xì)胞：37℃，5%的co2進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，培養(yǎng)5天，細(xì)胞融合率65-80%。

4、染色：每孔加入上述噻唑藍(lán)mtt原液20μl，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4h。

5、觀察：小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入200μl新鮮的培養(yǎng)液，并于高倍光學(xué)顯微鏡下觀察藍(lán)紫色顆粒數(shù)量。線粒體的數(shù)量為600-1900相對顆粒。

進(jìn)一步，本發(fā)明方法應(yīng)用于對成纖維細(xì)胞染色檢測分析線粒體數(shù)量，對成纖維細(xì)胞在37±0.5℃，5v%的co2進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，培養(yǎng)時間3-5天。

[實(shí)施例3]

活細(xì)胞線粒體數(shù)量染色檢測

對成纖維細(xì)胞進(jìn)行染色檢測分析線粒體數(shù)量，具體流程如下。

1、原液配制：噻唑藍(lán)mtt0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液（pbs，ph=7.4）中，用0.22μm濾膜過濾以除去細(xì)菌，放3℃避光保存。在配制和保存的過程中，容器用鋁箔紙包住避光。

2、接種細(xì)胞：將成纖維細(xì)胞用培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔約2000-10000個細(xì)胞接種到96孔板中，每孔體積200μl。

3、培養(yǎng)細(xì)胞：根據(jù)細(xì)胞類型設(shè)置培養(yǎng)條件，培養(yǎng)4天，細(xì)胞融合率60-80%。

4、染色：每孔加入上述噻唑藍(lán)mtt原液25μl，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4h。

5、觀察：小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)上清液20μl，加入250μl新鮮的培養(yǎng)液，并于高倍光學(xué)顯微鏡下觀察藍(lán)紫色顆粒數(shù)量。線粒體的數(shù)量為700-2000相對顆粒。

[實(shí)施例4]

活細(xì)胞線粒體數(shù)量染色檢測

對成纖維細(xì)胞進(jìn)行染色檢測分析線粒體數(shù)量，具體流程如下。

1、原液配制：噻唑藍(lán)mtt0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液（pbs，ph=7.4）中，用0.22μm濾膜過濾以除去細(xì)菌，放3℃避光保存。在配制和保存的過程中，容器用鋁箔紙包住避光。

2、接種細(xì)胞：將成纖維細(xì)胞用培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔約2000-10000個細(xì)胞接種到48孔板中，每孔體積300μl。

3、培養(yǎng)細(xì)胞：37℃，5%的co2進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，培養(yǎng)3天，細(xì)胞融合率60-80%。

4、染色：每孔加入上述噻唑藍(lán)mtt原液25μl，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育5h。

5、觀察：小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)上清液10μl，加入200μl新鮮的培養(yǎng)液，并于高倍光學(xué)顯微鏡下觀察藍(lán)紫色顆粒數(shù)量。線粒體的數(shù)量為800-1900相對顆粒。

[實(shí)施例5]

活細(xì)胞線粒體數(shù)量染色檢測

對成纖維細(xì)胞進(jìn)行染色檢測分析線粒體數(shù)量，具體流程如下。

1、原液配制：噻唑藍(lán)mtt0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液（pbs，ph=7.4）中，用0.22μm濾膜過濾以除去細(xì)菌，放4℃避光保存。

2、接種細(xì)胞：用培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔約2000-10000個細(xì)胞接種到96孔板中，每孔體積200μl。

3、培養(yǎng)細(xì)胞：37℃，5%的co2進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，培養(yǎng)4天，細(xì)胞融合率60-80%。

4、染色：每孔加入上述噻唑藍(lán)mtt原液30μl，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育5h。

5、觀察：小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)上清液40μl，加入300μl新鮮的培養(yǎng)液，并于高倍光學(xué)顯微鏡下觀察藍(lán)紫色顆粒數(shù)量。線粒體的數(shù)量為650-2000相對顆粒。

[對比例1]

活細(xì)胞線粒體膜電位檢測（流式細(xì)胞儀間接分析線粒體數(shù)量/功能）

采用流式細(xì)胞儀分析成纖維細(xì)胞線粒體膜電位，具體流程如下。

將成纖維細(xì)胞用培養(yǎng)液37℃，5%的co2進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，培養(yǎng)3天。取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶edta消化，用pbs制成細(xì)胞懸浮液，pbs漂洗3次，用jc-1（1mmol/l）進(jìn)行染色，37℃平衡30min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，計算綠色熒光與紅色熒光的比值（去極化程度）。

結(jié)果：通過流式細(xì)胞儀分析得到的該組細(xì)胞線粒體的膜電位去極化程度比值0.8，表明jc-1和流式細(xì)胞儀配合可分析該細(xì)胞線粒體的膜電位去極化變化，間接反映線粒體數(shù)量/功能的改變，該方法操作步驟較為繁瑣，且設(shè)備的成本較高。

注意：jc-1臨用時配制，-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。

[對比例2]

活細(xì)胞線粒體數(shù)量檢測（健那綠染色）

對成纖維細(xì)胞進(jìn)行健那綠染色檢測分析線粒體數(shù)量，具體流程如下。

健那綠染液配制：將0.5g健那綠溶解于50ml生理鹽水中，加熱到35-40℃，使其溶解。

用培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，37℃、5%co2恒溫培養(yǎng)2天。取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入等量健那綠染液，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)后，吸取培養(yǎng)上清液，加入500μl新鮮的培養(yǎng)液（96孔培養(yǎng)板），并于高倍倒置顯微鏡下觀察被染色的線粒體相對數(shù)量。

結(jié)果：健那綠染色以后，線粒體顯微鏡下為形態(tài)多樣的藍(lán)綠色的小顆粒，該組細(xì)胞線粒體的數(shù)量為750-1800相對顆粒。該方法與本發(fā)明申請的方法同樣具有操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，可互為補(bǔ)充。

注意：具有活性的細(xì)胞色素c氧化酶才能夠把健那綠氧化顯色，故該方法操作要迅速，以保證細(xì)胞的活性。另，健那綠染色速度快，顏色消退也快，故需要掌握檢測觀察的時機(jī)。