本發(fā)明公開了一種快速、高靈敏結(jié)合桿菌耐藥株鑒別與拉曼定量分析方法，屬于材料合成及生物傳感。

背景技術(shù)：

1、根據(jù)《2022年全球結(jié)核病報告》信息顯示，2021年全球估算的新發(fā)結(jié)核病患者1060萬，發(fā)病率為134/10萬。中國2021年估算的結(jié)核病新發(fā)患者數(shù)為78.0萬，在30個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家中我國估算結(jié)核病發(fā)病數(shù)排第3位。國內(nèi)帶菌人群多，發(fā)病人群多，死亡人群多。因此，為了更加有效地遏制多種結(jié)核桿菌的傳播，針對多種病原體的快速靈敏檢測已迫在眉睫。目前，針對病原體如結(jié)核病的感染，常見傳統(tǒng)的檢測方法主要是：①詢問病史和癥狀，體格檢查；②胸片、ct等影像學(xué)檢查；③痰涂片抗酸染色查抗酸桿菌；④分枝桿菌分離培養(yǎng)及菌種鑒定；⑤分子生物學(xué)檢測：痰涂片檢查是簡單、快速、易行和可靠的方法，但欠敏感，痰涂片檢查陽性只能說明痰中含有抗酸桿菌，不能區(qū)分是結(jié)核分枝桿菌還是非結(jié)核分枝桿菌。而分枝桿菌分離培養(yǎng)是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，但在體外培養(yǎng)周期長，一般為2-8周，陽性檢出率不高，因此對臨床的早期診斷和確定藥物治療都帶來一定的困難。聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌能大大提高結(jié)核分枝桿菌的檢出率和檢出特異性，但是傳統(tǒng)pcr法由于特異性不高或者抑制因子、標(biāo)本前處理、dna提取及操作方法不當(dāng)?shù)葐栴}，容易出現(xiàn)假陽性和假陰性問題。

2、此外更重要的是，隨著大量對結(jié)核病的用藥治療，結(jié)核桿菌逐漸的演化出了多種不同程度的耐藥菌株，如常見的：對兩種主要的抗結(jié)核藥物——異煙肼和利福平同時耐藥的多藥耐藥結(jié)核(mdr-tb)；：對異煙肼、利福平和/或吡嗪酰胺等抗結(jié)核藥物產(chǎn)生耐藥的性延遲耐藥結(jié)核(ddr-tb)；：除了異煙肼和利福平以外，還對兩種或以上的二線抗結(jié)核藥物(如阿米卡星、莫西沙星、環(huán)丙沙星、卡那霉素等)耐藥的極耐藥結(jié)核(xdr-tb)以及對所有的一線和二線抗結(jié)核藥物均耐藥的全耐藥結(jié)核(tdr-tb)。這些耐藥菌株的出現(xiàn)對結(jié)核病治療提出了重大挑戰(zhàn)。研究表明，在結(jié)核桿菌耐藥性產(chǎn)生的主要原因在于其特定基因序列的突變，現(xiàn)已研究出包括rpob、katg、gyra、gyrb和inha在內(nèi)的多種結(jié)核桿菌基因位點的突變與耐藥性存在明顯關(guān)聯(lián)。因此，針對結(jié)核桿菌特定突變位點，開發(fā)特異性基因檢測新方法，對結(jié)核桿菌耐藥株的鑒別與定量分析檢測均具有重要意義。

3、拉曼光譜分析技術(shù)是利用探針分子拉曼光譜信號，依據(jù)信號強度、位置信息而建立其的光譜定量分析方法。其分析響應(yīng)速度快、半峰寬窄非常適用于構(gòu)建多通道、快速分析探針，實現(xiàn)特定生物標(biāo)志物的高通量快速分析。更重要的是，表面增強拉曼光譜技術(shù)(sers)是一種利用納米材料與材料表面分子間相互作用增強分子拉曼信號的超靈敏分析檢測技術(shù)，其增強因子最高可以達(dá)到1010以上。因此，基于sers的分析技術(shù)通常具有極高的靈敏度，且響應(yīng)迅速，能夠?qū)崿F(xiàn)在多種環(huán)境下痕量物質(zhì)的分析檢測，而有效避免了rt-pcr分析方法中的核酸擴(kuò)增過程，大大節(jié)省了經(jīng)濟(jì)成本以及時間成本。此外，才sers基底材料的選擇方面，與傳統(tǒng)的貴金屬納米材料如au，ag，cu等相比，半導(dǎo)體納米材料基底在分析選擇性、信號穩(wěn)定性以及成本方面具有更大的優(yōu)勢。基于半導(dǎo)體納米材料而構(gòu)建sers基底材料以及結(jié)核桿菌拉曼分析探針在實現(xiàn)結(jié)核桿菌快速、準(zhǔn)確、靈敏鑒別分析以及降低成本方面具有重要作用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于利用半導(dǎo)體納米材料-cu2o發(fā)明了一種多通道結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼分析芯片，它具有分析速度快，分子選擇性高、檢測靈敏、價格低廉、易于保存等優(yōu)點。

2、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的核心發(fā)明點在于首先制備了一種半導(dǎo)體納米陣列作為表面增強拉曼光譜基底材料，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步設(shè)計制備了一種高選擇性、高靈敏度、價格低廉、易于保存的新型多通道結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼分析芯片，實現(xiàn)了對多種結(jié)核桿菌耐藥株的同時、靈敏、快速分析檢測。

3、本發(fā)明首先提供了一種新型表面增強拉曼sers基底材料的制備方法，包括以下步驟：

4、(1)采用醋酸銅(cuac2)、超純水、鄰甲氧基苯胺混合溶液作為反應(yīng)物，通過水熱反應(yīng)制備cu2o納米線；

5、(2)以步驟(1)中離心而得到的cu2o納米線為基礎(chǔ)，通過表面改性，油/水界面自組裝、加熱干燥等過程，在固體基片表面構(gòu)建sers基底材料。

6、步驟(1)中，所述的cuac2、超純水、鄰甲氧基苯胺的用量比為0.05g-0.2g：30-50ml：0.05-0.2mol/l；優(yōu)選地，為0.1g：50ml：0.1mol/l。

7、步驟(1)中，所述溶液混合的時間為15min-45min；優(yōu)選地，為30min。

8、步驟(1)中，所述水熱反應(yīng)釜的容積為50ml或100ml；優(yōu)選地，為50ml。

9、步驟(1)中，所述水熱反應(yīng)的溫度為160℃-200℃；優(yōu)選地，為180℃。

10、步驟(1)中，所述水熱反應(yīng)的時間為8h-15h；優(yōu)選地，為10h。

11、步驟(2)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為3000rpm-8000rpm；優(yōu)選地，為5000rpm。

12、步驟(2)中，所述離心的時間為3min-10min；優(yōu)選地，為5min。

13、步驟(2)中，所述cu2o納米線的表面改性活性劑為聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚氯乙烯(pvc)、聚苯乙烯(ps)等中的一種；優(yōu)選地，為聚苯乙烯(ps)。

14、其中，所述的表面改性活性劑修飾基團(tuán)為巰基(-sh)，氨基(-nh2)，羧基(-cooh)；優(yōu)選地，為氨基(-nh2)。

15、所述的表面改性活性劑的濃度為1mm-50mm；優(yōu)選地，為10mm。

16、步驟(2)中，所述cu2o納米線組裝所用的表面改性活性劑的分子量為100-1000000中的一種；優(yōu)選地，為100000。

17、步驟(2)中，所述的cu2o納米線的用量為10-100μg；優(yōu)選地，為20μg。

18、步驟(2)中，所述cu2o納米線表面改性所用溶劑為超純水或無水乙醇等中的一種；優(yōu)選地，為超純水。

19、步驟(2)中，所述cu2o納米線表面改性過程所用的時間為8-15h；優(yōu)選地，為12h。

20、步驟(2)中，所述cu2o納米線表面改性過程所用的溫度為20-40℃；優(yōu)選地，為30℃。

21、步驟(2)中，所述油/水界面為水/氯仿，水/環(huán)己烷，水/二氯甲烷等中的一種；優(yōu)選地，水/環(huán)己烷。

22、步驟(2)中，所述油/水界面的油/水比例為1:0.5-1:3；優(yōu)選地，為1:1。

23、步驟(2)中，所述油/水的分散溶劑的總體積為0.5-2ml；優(yōu)選地，為1ml。

24、步驟(2)中，所述干燥的溫度為40℃-80℃；優(yōu)選地，為60℃。

25、步驟(2)中，所述干燥的時間為10min-40min；優(yōu)選地，為20min。

26、在一個具體實施方式中，將0.1g?cuac2溶解于50ml超純水中，并向其中加入鄰甲氧基苯胺，濃度為0.1mol/l，將混合物充分?jǐn)嚢?0min后，轉(zhuǎn)移到50ml水熱反應(yīng)釜中，在烘箱中保溫180℃，10h。而后，將水熱反應(yīng)釜自然冷卻至室溫，將分散液轉(zhuǎn)移至離心管中，再5000rpm下離心取沉淀。進(jìn)一步，將氨基修飾分子量為100000的聚苯乙烯(nh2-ps)溶解于5ml超純水中，制備成10mm的nh2-ps溶液，向其中加入30μg?cu2o納米線沉淀，持續(xù)在30℃下攪拌12h。隨后，將所得納米線充分分散在500μl環(huán)己烷中，并轉(zhuǎn)移至2cm2單晶硅基底片表面。而后向單晶硅基底片表面滴加500μl超純水，待界面穩(wěn)定后，置于干燥環(huán)境，在60℃烘箱中緩慢蒸發(fā)，得到cu2o納米sers基底。

27、本發(fā)明還提供了由上述方法制備得到的半導(dǎo)體sers基底材料。

28、本發(fā)明還提供了所述半導(dǎo)體sers基底材料在構(gòu)建結(jié)核桿菌耐藥基因sers分析探針、分析芯片以及在結(jié)核桿菌耐藥基因分析方面中的應(yīng)用。

29、本發(fā)明還提供了一種結(jié)核桿菌耐藥基因sers分析探針的制備方法，其核心在于依據(jù)結(jié)核桿菌耐藥基因核酸序列，設(shè)計結(jié)核桿菌核酸基因識別序列作為識別單元，以前所構(gòu)建的半導(dǎo)體sers基底材料為信號放大單元，以對應(yīng)核酸信號序列作為信號單元，分別修飾拉曼信號分子與參比分子，利用偶聯(lián)劑實現(xiàn)信號序列-分子修飾以及基底-識別序列修飾，建立結(jié)核桿菌耐藥基因sers分析探針。具體步驟如下：

30、基于上述的半導(dǎo)體sers基底材料，針對特定結(jié)核桿菌耐藥基因序列設(shè)計核酸識別探針，并通過信號分子與參比分子修飾構(gòu)建結(jié)核桿菌耐藥基因sers分析探針。

31、其中，所述結(jié)核桿菌耐藥基因核酸基因序列為結(jié)合桿菌gyra、gyrb、rpob、inta以及katg序列等中的一種；優(yōu)選地，為rpob基因。

32、其中，所述核酸識別序列與核酸信號序列為dna分子或rna分子；優(yōu)選地，為dna分子。

33、其中，所述核酸識別序列的堿基數(shù)量為35-40nt；優(yōu)選地，為37nt。

34、其中，所述核酸信號序列的堿基數(shù)量為6-10nt；優(yōu)選地，為8nt。

35、其中，所述核酸識別序列5‘端修飾基團(tuán)為氨基、巰基、羥基、羧酸基等中的一種；優(yōu)選地，為巰基。

36、其中，所述核酸信號序列3‘端修飾基團(tuán)為氨基、巰基、羥基、羧酸基等中的一種；優(yōu)選地，為氨基。

37、其中，所述核酸識別序列的堿基序列為下列四種中的一種，

38、序列1：5’-sh-gcc?aac?tggagg?ccc?cag?cgc?caacag?tcg?gcg?ctt?t-3’(seq?idno.1)

39、序列2：5’-sh-gcc?gtcatg?tac?ctc?gat?gcc?ggt?ggt?gat?cgc?gtc?t-3’(seqid?no.2)

40、序列3：5’-sh-gcc?accaat?gat?gcg?cac?cag?ggt?gtc?gat?gat?cgat-3’(seq?idno.3)

41、序列4：5’-sh-gccact?ggtagc?ctgaac?ttc?ggg?gtt?ctt?tag?cac?t-3’(seq?idno.4)

42、優(yōu)選地，為序列1(seq?id?no.1)；

43、其中，所述核酸信號序列的堿基序列為下列四種中的一種，

44、5’-ccagtt?gg-nh2-3’；

45、5’-cat?gac?gg-nh2-3’

46、5’-att?ggt?gg-nh2-3’

47、5’-accagt?gg-nh2-3’

48、優(yōu)選地，為5’-ccagtt?gg-nh2-3’；

49、其中，所述拉曼信號分子為苝四甲酸二酐(ptcda)、羅丹明6g(r6g)、羅丹明b(rhb)、花菁及其衍生物、四氰基醌二甲烷(tcnq)及其衍生物、浴銅靈(bcp)及其衍生物、苯乙炔及其衍生物等中的一種；優(yōu)選地，為苝四甲酸二酐(ptcda)。

50、其中，所述的拉曼參比分子為苝四甲酸二酐(ptcda)、羅丹明6g(r6g)、羅丹明b(rhb)、花菁及其衍生物、四氰基醌二甲烷(tcnq)及其衍生物、浴銅靈(bcp)及其衍生物、苯乙炔及其衍生物等中的一種；優(yōu)選地，為四氰基醌二甲烷(tcnq)。

51、其中，所述參比分子溶液的濃度為100μm-2mm；優(yōu)選地，為1mm。

52、其中，所述參比分子溶液的體積為100μl-1000μl；優(yōu)選地，為500μl。

53、其中，所述參比分子的修飾時間為30min-60min；優(yōu)選地，為30min。

54、其中，所述信號序列-分子修飾所用的拉曼信號分子溶液的濃度為100μm-1000μm；優(yōu)選地，為500μm。

55、其中，所述序列-分子修飾所用的拉曼信號分子體系的總體積為1ml-20ml；優(yōu)選地，為10ml。

56、其中，所述序列-分子修飾所用的拉曼信號分子體系中的偶聯(lián)劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)，n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，比例為2:1。

57、其中，所述序列-分子修飾所用的拉曼信號分子體系中，核酸信號序列的用量為10μm-100μm；優(yōu)選地，為20μm。

58、其中，所述序列-分子修飾所用的反應(yīng)時間為10h-20h；優(yōu)選地，為16h。

59、其中，所述序列-分子修飾所用的反應(yīng)溫度為60℃-90℃；優(yōu)選地，為85℃。

60、其中，所述基底-識別序列修飾所用的核酸識別序列的濃度為10-50μm；優(yōu)選地，為20μm。

61、其中，所述基底-識別序列修飾所用的核酸識別序列的溶液的體積為100μl-1ml；優(yōu)選地，為500μl。

62、其中，所述基底-識別序列修飾所用的核酸識別序列的反應(yīng)溫度為20℃-50℃；優(yōu)選地，為37℃。

63、其中，所述基底-識別序列修飾所用的核酸識別序列的反應(yīng)時間為3h-5h；優(yōu)選地，為3h。

64、在一個具體實施方式中，所述結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼探針的制備步驟包括：將500μl濃度為20μm的核酸識別序列溶液滴加至所制備的sers基底表面，在37℃下恒溫孵育3h。而后將500μl，1mm的參比小分子tcnq滴加至上述納米陣列表面，進(jìn)一步在37℃下孵育30min，用超純水清洗表面3次，獲得結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼探針。同時，向濃度為20μm的核酸信號序列的1ml水溶液中加入10mg?1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)與5mgn-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，并其中加入苝四甲酸二酐(ptcda)使其濃度為500μm，將上述反應(yīng)體系繼續(xù)在85℃下恒溫反應(yīng)16小時，進(jìn)一步重復(fù)用1m的鹽酸100ml洗滌產(chǎn)物三次，并過濾保留沉淀，備用。

65、本發(fā)明還提供了基于上述結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼探針而構(gòu)建多通道結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼分析芯片。

66、本發(fā)明還提供了所述的結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼分析芯片在人工模擬痰液中針對結(jié)核桿菌耐藥基因進(jìn)行高特異性分析應(yīng)用。

67、本發(fā)明還提供了一種基于結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼探針而構(gòu)建的多通道核酸拉曼分析芯片的制備方法，包括以下步驟：

68、(1)以不同結(jié)核桿菌耐藥基因的核酸序列為監(jiān)測目標(biāo)，針對不同結(jié)核桿菌耐藥株，依照結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼探針的制備方法，分別設(shè)計的結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼探針。

69、(2)將步驟(1)所制備的一系列結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼探針均勻固定至大尺寸基底片表面，構(gòu)建多通道結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼分析芯片。

70、(3)以不同結(jié)核桿菌耐藥基因核酸序列為靶標(biāo)，制備結(jié)核桿菌耐藥基因痰液模擬樣本，并滴加至芯片表面，隨后加入含有核酸信號序列探針溶液，共同孵育后，采用拉曼光譜儀進(jìn)行光譜采集與數(shù)據(jù)分析。

71、步驟(1)中，所述結(jié)核桿菌耐藥基因為rpob、gyra、gyrb以及katg等中的一種或多種；優(yōu)選地，為rpob。

72、步驟(1)中，所述特異性識別拉曼探針中，核酸識別序列分別為：

73、rpob：seq?id?no.1

74、katg：seq?id?no.2

75、gyra：seq?id?no.3

76、gyrb：seq?id?no.4

77、步驟(1)中，所述特異性識別拉曼探針中，核酸信號序列分別為：

78、rpob：5’-ccagtt?gg-nh2-3’；

79、katg：5’-cat?gac?gg-nh2-3’

80、gyra：5’-att?ggt?gg-nh2-3’

81、gyrb：5’-accagt?gg-nh2-3’

82、步驟(2)中，所述基底片為玻璃片、石英片、云母片等中的一種；優(yōu)選地，為石英片。

83、步驟(3)中，所述結(jié)核桿菌變異株痰液模擬樣本的體積為200μl-800μl；優(yōu)選地，為500μl。

84、步驟(3)中，所述共同孵育的溫度為30℃-80℃；優(yōu)選地，為60℃。

85、步驟(3)中，所述共同孵育的時間為1-10min；優(yōu)選地，為5min。

86、步驟(3)中，含有核酸信號序列探針溶液的體積為100μl-500μl；優(yōu)選地，為200μl。

87、步驟(3)中，含有核酸信號序列探針溶液的濃度為0.5-2μm；優(yōu)選地，為1μm。

88、步驟(3)中，拉曼光譜測試所使用的激光波長為532nm、633nm和785nm中的一種；優(yōu)選地，為633nm。

89、步驟(3)中，所述拉曼光譜測試所使用的激光功率為0.5-5mw；優(yōu)選地，為1mw。

90、步驟(3)中，所述拉曼光譜測試所使用的測試曝光時間為0.5-2s；優(yōu)選地，為1s。

91、在一個具體的實施方式中，所述多通道結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼分析芯片的制備與結(jié)核桿菌耐藥基因檢測方法包括：首先，依據(jù)結(jié)核桿菌耐藥基因核酸序列，對應(yīng)設(shè)計不同的核酸識別序列與核酸信號序列，并制備結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼探針，而后以石英片為基底，將不同的結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼探針均勻固定在石英基底片表面，以4通道結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼分析芯片為例，采用1通道對照組與3通道結(jié)核桿菌耐藥基因檢測組的設(shè)計制備多通道拉曼分析芯片，將500μl含有不同濃度、不同核酸序列的結(jié)核桿菌痰液模擬樣本，200μl含有1μm經(jīng)過修飾的核酸信號序列的混合溶液滴加至拉曼分析芯片表面，并在60℃下孵育5min。以拉曼光譜儀進(jìn)行檢測，其中拉曼光譜儀所使用的激光波長為633nm，激光功率為1mw，曝光時間為1s。

92、本發(fā)明中，可通過測定信號分子ptcda與參比分子tcnq在sers基底芯片上的不同程度的拉曼增強效果，以ptcda拉曼信號強度與tcnq拉曼信號強度比值，來實現(xiàn)對樣品中結(jié)核桿菌耐藥基因的特異性分析檢測。

93、在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述多通道結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼分析芯片構(gòu)建方法以及針對結(jié)核桿菌耐藥基因核酸的檢測方法，包括以下步驟：

94、(1)sers基底材料的制備

95、將0.1g?cuac2溶解于50ml超純水中，并向其中加入鄰甲氧基苯胺，濃度為0.1mol/l，將混合物充分?jǐn)嚢?0min后，轉(zhuǎn)移到50ml水熱反應(yīng)釜中，在烘箱中保溫180℃，10h。而后，將水熱反應(yīng)釜自然冷卻至室溫，將分散液轉(zhuǎn)移至離心管中，再5000rpm下離心取沉淀。進(jìn)一步，將氨基修飾分子量為100000的聚苯乙烯(nh2-ps)溶解于5ml超純水中，制備成10mm的nh2-ps溶液，向其中加入30μg?cu2o納米線沉淀，持續(xù)在30℃下攪拌12h。隨后，將所得納米線充分分散在500μl環(huán)己烷中，并轉(zhuǎn)移至2cm2單晶硅基底片表面。而后向單晶硅基底片表面滴加500μl超純水，待界面穩(wěn)定后，置于干燥環(huán)境，在60℃烘箱中緩慢蒸發(fā)，得到cu2o納米sers基底材料。

96、(2)拉曼分析探針的構(gòu)建

97、所述結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼分析探針的制備步驟包括：將500μl濃度為20μm的核酸識別序列溶液滴加至前述制備的sers基底材料表面，在37℃下恒溫孵育3h。而后將500μl，1mm的參比小分子tcnq滴加至上述納米陣列表面，進(jìn)一步在37℃下孵育30min，用超純水清洗表面3次，獲得結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼探針。同時，向濃度為20μm的核酸信號序列的1ml水溶液中加入10mg?1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)與5mgn-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，并其中加入苝四甲酸二酐(ptcda)使其濃度為500μm，將上述反應(yīng)體系繼續(xù)在85℃下恒溫反應(yīng)16小時，進(jìn)一步重復(fù)用1m的鹽酸100ml洗滌產(chǎn)物三次，并過濾保留沉淀，備用。

98、(3)多通道拉曼分析芯片的構(gòu)建與結(jié)核桿菌耐藥菌株痰液模擬樣本分析

99、所述多通道結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼分析芯片的制備與結(jié)核桿菌耐藥菌株檢測方法包括：首先，依據(jù)結(jié)核桿菌耐藥基因核酸序列，對應(yīng)設(shè)計不同的核酸識別序列與核酸信號序列，并制備結(jié)核桿菌耐藥基因探針，而后以石英片為基底，將不同的結(jié)核桿菌耐藥基因探針均勻固定在石英基底片表面，以4通道結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼分析芯片為例，采用1通道對照組與3通道(4通道分別為：1.陰性實驗對照組檢測通道；2.結(jié)核桿菌rpob基因；3.結(jié)核桿菌katg基因；4.結(jié)核桿菌gyrb基因；)結(jié)核桿菌耐藥基因檢測組的設(shè)計制備多通道拉曼分析芯片，將500μl含有不同濃度、不同核酸序列的結(jié)核桿菌耐藥菌株的痰液模擬樣本，200μl含有1μm經(jīng)過修飾的核酸信號序列的混合溶液滴加至拉曼分析芯片表面，并在60℃下孵育5min。以拉曼光譜儀進(jìn)行檢測，其中拉曼光譜儀所使用的激光波長為633nm，激光功率為1mw，曝光時間為1s。

100、本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明首先基于cu2o納米線，通過材料自組裝構(gòu)建了具有高增強效果的表面增強拉曼光譜基底材料。并在此基礎(chǔ)上，針對結(jié)核桿菌耐藥基因核酸序列，特異性設(shè)計了系列具有結(jié)核桿菌耐藥菌株識別區(qū)分能力多種拉曼分析探針，并進(jìn)一步通過空間組合，設(shè)計制造了多通道結(jié)核桿菌耐藥基因拉曼分析芯片，實現(xiàn)了多種結(jié)核桿菌耐藥基因核酸序列的同時分析檢出?；趕ers基底材料對信號分子ptcda、tcnq的超高靈敏度、高選擇性拉曼增強作用，以ptcda分子月tcnq分子的拉曼峰強度比值作為定量依據(jù)，在不使用生物酶與核酸擴(kuò)增技術(shù)的前提下，實現(xiàn)了不同結(jié)核桿菌耐藥基因核酸的序列的多通道同時靈敏檢出，檢測限達(dá)到了48copies/ml，平均檢測時間僅為5min。該芯片不僅能夠?qū)崿F(xiàn)結(jié)核桿菌耐藥菌株核酸的快速檢測篩查，單次檢測成本僅需1元，相關(guān)檢測試劑能夠?qū)崿F(xiàn)在常溫下保存6個月以上，大大節(jié)約了經(jīng)濟(jì)成本以及時間成本。為結(jié)核桿菌耐藥基因的快速篩查分析提供了高靈敏、高選擇、高穩(wěn)定的生物分析平臺，在病原體檢測與防控方面具有重大積極作用。