本發(fā)明屬于生物分析，具體涉及一種基于標(biāo)記聯(lián)用的高通量單細(xì)胞蛋白組學(xué)分析方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：1、現(xiàn)階段最主要的提高通量的標(biāo)記定量的蛋白質(zhì)組學(xué)方法有：同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)（isobaric?tags?for?relative?and?absolute?quantification，itraq）、串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記技術(shù)（tandem?mass?tag，tmt）、細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)（stable-isotope?labelling?by?amino?acids?in?cell?culture，silac）、基于非標(biāo)記定量技術(shù)（label-free）。2、itraq技術(shù)是由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司abi研發(fā)的一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)。itraq技術(shù)利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽n末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)，經(jīng)高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，可同時(shí)比較最多10種樣品之間的蛋白表達(dá)量，是近年來(lái)定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)；tmt技術(shù)是由美國(guó)thermo?scientific公司研發(fā)的一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)。與itraq技術(shù)原理相同，優(yōu)勢(shì)類似，但是比itraq擁有更多的標(biāo)簽數(shù)，能一次上機(jī)更多樣品。tmt技術(shù)采用6種、10種，16種或18種同位素標(biāo)簽，特異性標(biāo)記多肽的氨基基團(tuán)，然后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，監(jiān)測(cè)碎裂下來(lái)的標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)肽段定量。一次實(shí)驗(yàn)可同時(shí)比較最多18組不同樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量；silac是一種通過(guò)使用13c-葡萄糖、15nh或3c標(biāo)記氨基酸的培養(yǎng)基引入穩(wěn)定同位素，標(biāo)記細(xì)胞或小生物體內(nèi)的蛋白并根據(jù)質(zhì)譜豐度比率進(jìn)行定量的體內(nèi)代謝標(biāo)記技術(shù)。最初silac使用的標(biāo)記氨基酸是氚代甲硫氨酸和氘代甘氨酸，目前常用的標(biāo)記氨基酸有亮氨酸、精氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸等；蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量技術(shù)（label-free）是經(jīng)典的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。該技術(shù)無(wú)需昂貴的同位素（itraq和tmt）標(biāo)簽做內(nèi)標(biāo)，而是通過(guò)比較質(zhì)譜分析次數(shù)或質(zhì)譜峰強(qiáng)度，分析不同來(lái)源樣品蛋白的數(shù)量變化。該方法認(rèn)為肽段在質(zhì)譜中被捕獲檢測(cè)的頻率與其在混合物中的豐度成正相關(guān)，因此蛋白質(zhì)被質(zhì)譜檢測(cè)的計(jì)數(shù)反映了蛋白質(zhì)的豐度，通過(guò)適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)公式可以將質(zhì)譜檢測(cè)計(jì)數(shù)與蛋白質(zhì)的量聯(lián)系起來(lái)，從而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量；目前，該技術(shù)廣泛用到的標(biāo)記試劑是tmt系列和itraq，以及ibt系列。3、現(xiàn)有的基于tmt或ibt的標(biāo)記技術(shù)，在orbitrap類質(zhì)譜上最高可做到18標(biāo)，在timstof?scp或者timstof?pro質(zhì)譜（由于分辨率低于5萬(wàn)，標(biāo)記試劑只能間隔使用，總共可使用一半的標(biāo)簽）上最高可做到9標(biāo)，通量無(wú)法再提高。silac對(duì)于樣品類型有限制，只適用于活體培養(yǎng)的細(xì)胞，組織和體液樣品是沒(méi)法分析的，且通量低；另外，不使用標(biāo)記的非標(biāo)定量技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)操作穩(wěn)定性要求較高，通量低。4、已經(jīng)有報(bào)道利用標(biāo)記聯(lián)用來(lái)提高單細(xì)胞蛋白組的通量，如參考文獻(xiàn)anal.?chem.2023，?95，?5169?5175中將tmtpro?18plex，ibt-16plex以及tmtpro?11plex三種標(biāo)記試劑聯(lián)用起來(lái)，對(duì)常規(guī)量的蛋白組在orbitrap質(zhì)譜平臺(tái)上可以進(jìn)行單次分析45個(gè)樣品，但是常規(guī)量的樣品需要分級(jí)成20個(gè)組分，這樣實(shí)際的通量提升只有約2.25倍。tmtpro?18plex與tmtpro?11plex在ms2中有11個(gè)共享通道（即tmtpro?11plex的所有通道），m/z完全一樣而無(wú)法區(qū)分，這導(dǎo)致定量準(zhǔn)確性下降。而且，這個(gè)聯(lián)用方法在比較時(shí)仍然是tmtpro?18plex，ibt-16plex以及tmtpro?11plex這3種標(biāo)記試劑標(biāo)記的樣品分組分別比較的，沒(méi)有整體比較，沒(méi)有實(shí)現(xiàn)真正的聯(lián)用。5、將tmt-16和ibt-16聯(lián)合起來(lái)用于單細(xì)胞蛋白組，還沒(méi)有報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的以上問(wèn)題，本發(fā)明將tmtpro?16plex和ibt-16plex聯(lián)用后用于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)，提供一種基于標(biāo)記聯(lián)用的高通量單細(xì)胞蛋白組學(xué)方法及應(yīng)用，本發(fā)明的單細(xì)胞蛋白組學(xué)分析方法可以將單細(xì)胞樣品的檢測(cè)通量最大提升30倍。2、本發(fā)明的技術(shù)方案為：3、一種基于標(biāo)記聯(lián)用的高通量單細(xì)胞蛋白組學(xué)分析方法，所述方法基于串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記技術(shù)，包括在單細(xì)胞多肽樣本中添加標(biāo)記試劑的步驟，所述標(biāo)記試劑由tmtpro?16plex和ibt-16plex組成。4、tmtpro的結(jié)構(gòu)式如下：5、6、ibt-16plex的結(jié)構(gòu)式如下：7、8、tmtpro?16plex同位素標(biāo)記試劑其結(jié)構(gòu)上有一個(gè)更長(zhǎng)的連接基團(tuán)和一個(gè)報(bào)告基團(tuán)，報(bào)告基團(tuán)含9個(gè)穩(wěn)定的c13和n15同位素，可以支持更多的通道。9、ibt-16plex是最近開(kāi)發(fā)出來(lái)的國(guó)產(chǎn)標(biāo)記試劑，它的報(bào)告離子質(zhì)量在114到122之間，與tmt系列試劑(126?-135)相比，它的報(bào)告離子跟tmtpro?16plex是完全不同的，兩者間沒(méi)有共享通道。這樣，來(lái)自不同標(biāo)記試劑的報(bào)告離子的干擾可以避免。10、本技術(shù)方案通過(guò)tmtpro?16plex和ibt-16plex標(biāo)記試劑聯(lián)合使用，可以單次分析多個(gè)單細(xì)胞樣品，如在一實(shí)施例中16個(gè)單細(xì)胞樣品，單個(gè)標(biāo)記通道鑒定量能達(dá)到3?000個(gè)蛋白左右，大大提升檢測(cè)通量，而且也具有高的技術(shù)靈敏度。11、優(yōu)選地，本發(fā)明方案的分析方法包括如下步驟：12、1）提取單細(xì)胞蛋白，獲取單細(xì)胞多肽樣本；此步驟沒(méi)有太多限制，依據(jù)不同細(xì)胞類型，按照常規(guī)提取方法加入裂解液酶解液等裂解細(xì)胞提取多肽即可。13、2）在所述單細(xì)胞多肽樣本中添加標(biāo)記試劑，混合，反應(yīng)，制備得到質(zhì)譜上樣樣品；14、優(yōu)選地，所述步驟2）中，將單一的不同標(biāo)簽的所述標(biāo)記試劑先分別加入單一的反應(yīng)容器中，和多肽樣本混合、反應(yīng)，終止反應(yīng)后，再將各單個(gè)反應(yīng)容器中樣本離心后混合，得到質(zhì)譜上樣樣品。這樣一次可以分析多個(gè)細(xì)胞，提升檢測(cè)通量。15、優(yōu)選地，所述步驟2）中，各單一反應(yīng)容器中，蛋白濃度為0-5?ng/μl。16、優(yōu)選地，所述步驟2）中，各單一反應(yīng)容器中，單一標(biāo)簽的標(biāo)記試劑的濃度為0.5-5μg/μl。17、3）上樣質(zhì)譜分析，獲取各標(biāo)記通道的蛋白數(shù)定性數(shù)據(jù)。對(duì)于質(zhì)譜類型沒(méi)有特別要求，質(zhì)譜進(jìn)樣測(cè)量方法按照常規(guī)操作即可。18、進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明的分析方法，還包括步驟：4）采用歸一化方法對(duì)所述獲取的各標(biāo)記通道的蛋白數(shù)定性數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。歸一化處理后，?tmtpro?16plex與ibt-16plex試劑的靈敏度差異被拉平，更有利于整體聯(lián)用分析。19、優(yōu)選地，所述歸一化方法可以是對(duì)每個(gè)蛋白構(gòu)建轉(zhuǎn)換系數(shù)進(jìn)行歸一化處理，也可以是采用額外的參考通道校正進(jìn)行歸一化處理，具體地，20、對(duì)每個(gè)蛋白構(gòu)建轉(zhuǎn)換系數(shù)進(jìn)行歸一化；即根據(jù)ibt組和tmt組的定量搜庫(kù)結(jié)果，合并獲得共同鑒定到的蛋白質(zhì)表達(dá)矩陣，在合并的蛋白質(zhì)矩陣中獲取不同組各個(gè)標(biāo)記通道的定量數(shù)據(jù)，利用最小值對(duì)缺失值進(jìn)行填充，獲取定量矩陣不同蛋白不同標(biāo)記通道定量結(jié)果的均值，構(gòu)成針對(duì)不同蛋白獨(dú)有的tmt-ibt兩組間的轉(zhuǎn)換系數(shù)，利用蛋白轉(zhuǎn)換系數(shù)對(duì)其他樣本的各個(gè)標(biāo)記通道定量結(jié)果進(jìn)行轉(zhuǎn)換。21、采用額外的參考通道校正進(jìn)行歸一化處理，即在ibt和tmt的每組各額外拿出一個(gè)通道作為參考通道，參考通道加入相同量的標(biāo)準(zhǔn)品，即各種蛋白量是固定的，因而其他通道且多個(gè)批次的樣品都可以使用參考通道校正，得到相對(duì)定量的結(jié)果。校正后整體比例也符合樣品本身的定量關(guān)系；22、優(yōu)選地，所述參考通道加入1-3x單細(xì)胞樣品量的標(biāo)準(zhǔn)品。參考通道可以為任意一個(gè)通道，通常為第一通道，但也可以是其他通道。23、本發(fā)明方案中，所述質(zhì)譜可以為timstof?scp質(zhì)譜、timstof?ht質(zhì)譜、?timstofultra質(zhì)譜、orbitrap質(zhì)譜、或astral質(zhì)譜等高分辨質(zhì)譜。24、本發(fā)明的另一方面，還提供了所述的基于標(biāo)記聯(lián)用的高通量單細(xì)胞蛋白組學(xué)分析方法在單細(xì)胞或少量細(xì)胞的蛋白質(zhì)組組學(xué)分析和鑒定中的應(yīng)用。25、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：26、本發(fā)明的基于標(biāo)記聯(lián)用的高通量單細(xì)胞蛋白組學(xué)分析方法，具有通量高且靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，在通量上遠(yuǎn)超現(xiàn)有的水平，檢測(cè)深度上也明顯優(yōu)于目前發(fā)表的較高通量的標(biāo)記類方法，并且首次實(shí)現(xiàn)不同標(biāo)記試劑間整體的比較。結(jié)合聯(lián)用標(biāo)記技術(shù)，可以在timstofscp上單次使用16個(gè)標(biāo)記通道，在其他更高分辨率質(zhì)譜上可單次使用32個(gè)標(biāo)記通道。單個(gè)標(biāo)記通道鑒定量能達(dá)到約3000個(gè)蛋白。相較于無(wú)標(biāo)記單細(xì)胞蛋白組定量技術(shù)，本發(fā)明技術(shù)大大提高了質(zhì)譜的檢測(cè)通量，節(jié)約了時(shí)間成本。相較于其他標(biāo)記定量單細(xì)胞蛋白組技術(shù)，本發(fā)明技術(shù)靈敏度高，對(duì)蛋白的鑒定深度有明顯優(yōu)勢(shì)。當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12