本發(fā)明屬于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種高血壓多項聯(lián)合測定試劑盒。

背景技術(shù)：

1、高血壓是人類最常見的心血管系統(tǒng)疾病，是導(dǎo)致冠心病、心肌梗死、腦卒中、腎功能不全甚至死亡的重要危險因素，致殘，致死率高。國內(nèi)外的實踐證明，高血壓是可以預(yù)防和控制的疾病，降低高血壓患者的血壓水平，可以明顯減少腦卒中及心臟病事件，顯著改善患者的生存質(zhì)量，有效降低疾病負擔(dān)。高血壓分為原發(fā)性及繼發(fā)性兩大類，在絕大多數(shù)患者中，高血壓的病因不明確，以非特異性血壓持續(xù)升高為主要表現(xiàn)，稱之為原發(fā)性高血壓，占總高血壓者的90%以上；在不足10%的患者中，血壓升高是某些疾病的一種臨床表現(xiàn)，本身有明確而獨立的病因，稱之為繼發(fā)性高血壓。

2、臨床上對高血壓患者，除了詳細詢問患者病史外，還會進行全面的體格檢查，尤其是做一些輔助檢查，其目的是查明引起血壓異常升高的病因，鑒別原發(fā)性和繼發(fā)性高血壓。歐洲高血壓學(xué)會和歐洲心臟病學(xué)會指出所有高血壓人群均應(yīng)進行簡單的繼發(fā)性高血壓篩查。血漿醛固酮（aldosterone,?ald）、皮質(zhì)醇（cortisol）、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotrophic?hormone，acth）、腎素（renin）、血管緊張素ⅱ（angiotensin?ⅱ,aⅱ），對繼發(fā)性高血壓的鑒別以及原發(fā)性高血壓的分型診斷及治療具有重要意義，并且可以對腎素－血管緊張素－醛固酮（renin－angiotensin－aldosterone?system,?raas）系統(tǒng)和下丘腦－垂體－腎上腺皮質(zhì)（hypothalamus－pituitary?gland－adrenal?cortex,hpa）軸進行聯(lián)合檢測分析，鑒別診斷由raas系統(tǒng)異常和hpa軸異常所導(dǎo)致的各種疾病。鑒于高血壓五項在臨床應(yīng)用方面的重要性，其檢測結(jié)果的可靠性受到臨床和實驗室越來越多的關(guān)注。

3、血清皮質(zhì)醇是腎上腺皮質(zhì)束狀帶合成、分泌的一種最主要的糖皮質(zhì)激素，其分泌受下丘腦－垂體－腎上腺（hpa）軸調(diào)節(jié)。皮質(zhì)醇是hpa軸功能的主要信息因子，其水平在人體內(nèi)呈節(jié)律性變化，當(dāng)hpa軸調(diào)節(jié)功能發(fā)生紊亂時，皮質(zhì)醇水平會發(fā)生變化，并反向影響hpa軸的調(diào)節(jié)功能。皮質(zhì)醇增多與血壓之間有一定聯(lián)系，高水平血清皮質(zhì)醇可導(dǎo)致高血壓。acth由腦垂體前葉分泌，研究顯示acth水平升高可引發(fā)異位acth綜合征，引起高血壓等癥狀。機體應(yīng)激時，通過下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)（hpa）軸釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（crh），后者使垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素（acth），acth作用于腎上腺皮質(zhì)使其釋放糖皮質(zhì)激素。糖皮質(zhì)激素又反饋抑制下丘腦、垂體釋放肽類激素，以達到自穩(wěn)作用。hpa軸的紊亂會導(dǎo)致皮質(zhì)醇增多癥、嗜鉻細胞瘤、原發(fā)性醛固酮增多癥、先天性腎上腺皮質(zhì)增生等腎上腺疾病，引起繼發(fā)性高血壓。因此檢測hpa軸對繼發(fā)性高血壓的診斷具有重要意義。

4、腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)（raas）?是由腎臟和肝臟分泌的一組相互作用又相互調(diào)節(jié)的激素與受體系統(tǒng)，在血壓的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，對高血壓的發(fā)生發(fā)展有著重要的意義。腎素作用于血管緊張素原產(chǎn)生血管緊張素ⅰ，而血管緊張素ⅰ通過血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的作用水解產(chǎn)生血管緊張素ⅱ。血管緊張素ⅱ通過促進血管收縮和腎上腺皮質(zhì)分泌醛固酮引起高血壓。

5、腎素、血管緊張素、醛固酮三者是一個相連的作用系統(tǒng)，通過對血容量和外周阻力的控制，調(diào)節(jié)人體血壓、水和電解質(zhì)平衡，來維持機體內(nèi)環(huán)境恒定。當(dāng)血壓降低時，腎臟開始分泌腎素，腎素可以使血管緊張素原轉(zhuǎn)化為血管緊張素i，并在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的作用下生成血管緊張素ii。血管緊張素ii使血管收縮，導(dǎo)致血壓升高，同時也可作為效應(yīng)分子刺激醛固酮的釋放，醛固酮有保鈉排鉀的作用，能引起血壓增高，導(dǎo)致高血壓。所以檢測raas指標對高血壓的診斷、分型、指導(dǎo)用藥有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種血漿醛固酮（aldosterone,?ald）、皮質(zhì)醇（cortisol）、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotrophic?hormone，acth）、腎素（renin）、血管緊張素ⅱ（angiotensin?ⅱ,?aⅱ）五項高血壓聯(lián)合測定試劑盒。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

3、一種高血壓多項聯(lián)合測定試劑盒，試劑盒由測試卡、ic卡、樣本稀釋液組成；

4、樣本稀釋液包括tris-hcl?緩沖液、牛血清白蛋白和解離試劑等；

5、測試卡由試紙條、塑料卡殼組成，試紙條上的主要成分有：

6、a)高血壓五項的單克隆抗體和小分子抗原，固定在硝酸纖維素膜上；

7、b)兔抗雞igy多克隆抗體，固定在硝酸纖維素膜上；

8、c)熒光標記的高血壓五項單克隆抗體，固定在玻璃纖維上；

9、d)熒光標記的雞igy抗體，固定在玻璃纖維上。

10、進一步地，所述的固定在硝酸纖維素膜上的單克隆抗體和小分子抗原分別為cor鼠單克隆抗體、acth鼠單克隆抗體、rein鼠單克隆抗體以及偶聯(lián)牛血清白蛋白（bsa）的ald與aⅱ的小分子抗原(bsa-ald與bsa-aⅱ)。所述的cor鼠單克隆抗體、acth鼠單克隆抗體和rein鼠單克隆抗體可分別特異性捕獲待測樣本中cor?、acth、rein抗原。所述的偶聯(lián)牛血清白蛋白（bsa）的ald與aⅱ的小分子抗原可以特異性與待測樣本中ald與aⅱ競爭性結(jié)合熒光標記的ald與aⅱ單克隆抗體。所述其在硝酸纖維素膜上的先后順序分別為cor鼠單克隆抗體、bsa-?aⅱ、acth鼠單克隆抗體、bsa-?ald及rein鼠單克隆抗體，相互間隔3-5mm。進一步地，所述的兔抗雞igy多克隆抗體，固定在硝酸纖維素膜上，在rein鼠單克隆抗體位置后3-5mm處，可特異性捕獲熒光標記的雞igy，作為公共參考質(zhì)控線。進一步地，所述熒光標記抗體制備方法為：nhs活化生物素溶于無水dmf有機溶劑中，在pbs緩沖體系中與抗體上的氨基進行反應(yīng)，生成生物素偶聯(lián)標記的單克隆抗體，然后與具有鏈霉親和素融合表達的熒光蛋白在含有bsa的pbs溶液中在室溫攪拌混合反應(yīng)10min，獲得抗體蛋白熒光顆粒。加入生物素進行終止反應(yīng)，透析3次去除多余的生物素。所述抗體標記的熒光物質(zhì)亦可為熒光微球、量子點、時間分辨熒光微球等熒光物質(zhì)。所述pbs反應(yīng)體系ph為6.5-8.0，bsa濃度為0.5%-5.0%。進一步地，nhs活化生物素與單克隆抗體的摩爾比例4-40：1，生物素標記抗體與鏈霉親和素?zé)晒獾鞍追磻?yīng)比例為1：2-10。進一步地，所述ald、cor、acth、renin、aⅱ五種熒光標記抗體與熒光標記的雞igy抗體分按濃度0.05mg/ml-0.5mg/ml混勻一起噴涂于經(jīng)過預(yù)處理的玻璃纖維墊上。進一步地，樣本稀釋液主要由tris-hcl?緩沖液、牛血清白蛋白等作為穩(wěn)定劑和封閉劑組成。通過tris-hcl調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)ph環(huán)境。所述ph為5.5-8.4。通過表面活性劑使反應(yīng)物均勻分散促進反應(yīng)，所述表面活性劑為吐溫-20，濃度為0.05%-0.3%（v/v）。以蛋白和糖類等作為封閉劑和穩(wěn)定劑，封閉非特異性結(jié)合反應(yīng)，所述蛋白可為牛血清白蛋白、酪蛋白等，濃度為0.5%-5.0%（m/v），糖類可為蔗糖、海藻糖等，濃度為0.3%-4.0%（m/v）。解離試劑為與糖皮質(zhì)類固醇結(jié)合蛋白的親和力比cortisol強的結(jié)構(gòu)類似物，可包括孕酮、ans鹽等一個或多個，用于競爭性解離樣本中與糖皮質(zhì)類固醇結(jié)合蛋白的cortisol，通過與tris-hcl緩沖液，以及調(diào)節(jié)其類似物與糖皮質(zhì)類固醇結(jié)合蛋白的結(jié)合力達到最適條件，使樣本中皮質(zhì)醇得到全部釋放，并使五種標志物在同一個試紙條上交叉反應(yīng)影響最小。

11、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果為：本發(fā)明的試劑盒是利用了側(cè)向流層析技術(shù)和免疫熒光標記技術(shù)，聯(lián)合采用雙抗體夾心法和競爭法原理進行檢測。在激發(fā)光源的作用下，熒光物質(zhì)發(fā)射特定波長的熒光信號，熒光免疫分析儀俘獲熒光信號，通過信號轉(zhuǎn)化及設(shè)定的定標曲線自動轉(zhuǎn)化為定量數(shù)值，計算出樣本中血漿醛固酮、皮質(zhì)醇、促腎上腺皮質(zhì)激素、腎素、血管緊張素ⅱ五項高血壓標志物的濃度。通過樣本稀釋液添加解離試劑可以提高試劑盒的準確度和靈敏度，該檢測方法獨特，便攜、速度快只需10-15分鐘即可出結(jié)果、特異性高。血漿醛固酮、皮質(zhì)醇、促腎上腺皮質(zhì)激素、腎素、血管緊張素ⅱ的聯(lián)合檢測對查明引起血壓異常升高的原因，鑒別高血壓是原發(fā)性還是繼發(fā)性，指導(dǎo)用藥有重要的臨床價值，具有極大的市場前景。

12、但目前相關(guān)檢測方法主要以化學(xué)發(fā)光免疫檢測和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法為主，存在操作復(fù)雜、成本高、速度慢等問題，或者檢測分析時需要一個指標進行分析。

13、例如，馮振等發(fā)明的同時檢測血液樣本中醛固酮和腎素活性的方法及試劑盒cn13049697?a，可同時實現(xiàn)醛固酮和腎素活性檢測。譚曉杰發(fā)明的同時檢測多種血壓升高相關(guān)的典型生物標記物的方法cn115541741?a，成功地實現(xiàn)了和血壓升高相關(guān)的醛固酮、皮質(zhì)醇10種生物標記物同時檢測的目的，提高了解決血壓升高原因分析效率，解決了通量和效率問題，也使操作過程大大簡化。劉鵬云等發(fā)明的原發(fā)性醛固酮增多癥篩查試劑盒以及確診和分型診斷系統(tǒng)cn?114895043?a，通過采用表面鍵合親水親脂平衡聚合物的磁珠進行樣本前處理，并優(yōu)化工藝條件，再經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜一次性精確檢測樣本中的醛固酮、血管緊張素ⅰ、血管緊張素ⅱ、皮質(zhì)醇和18-羥皮質(zhì)酮等5種標志物含量。這些檢測均采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法進行優(yōu)化檢測，但整體操作要求較高，存在操作復(fù)雜、對臨床使用要求更高及檢測時間長等問題。黃燕玲等發(fā)明的促腎上腺皮質(zhì)激素化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒cn108548930?b，采用磁微粒包被及吖啶酯標記的抗促腎上腺皮質(zhì)激的單克隆抗體的雙抗體法進行檢測。以及譚子燊公開了一種化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒cn?117031011?a，基于改進的雙抗夾心法用于小分子化合物的抗原的檢測，將第一抗體偶聯(lián)磁珠和第二抗體標記化學(xué)發(fā)光劑吖啶酯?；瘜W(xué)發(fā)光檢測法靈敏度高穩(wěn)定性好等特點，但同樣存在儀器設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、時間長且智能一個指標檢測等問題。