本發(fā)明屬于納米酶分析檢測領(lǐng)域，具體涉及一種銅基納米酶在茶多酚抗氧化能力雙模檢測方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在人體內(nèi)存在這一個活性氧濃度平衡，當(dāng)活性氧(reactive?oxygen?species,ros)濃度增加到超出正常水平時，它們會對細(xì)胞成分，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和dna產(chǎn)生有害影響，從而導(dǎo)致許多疾病，包括癌癥、糖尿病、神經(jīng)疾病、動脈粥樣硬化、高血壓、急性呼吸綜合癥、哮喘等。ros引起的氧化應(yīng)激還會打破機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的平衡。人們普遍認(rèn)為，茶葉具有抗氧化、抗腫瘤、防輻射和延緩衰老等多種優(yōu)良的生理活性。研究茶葉對人體抗氧化防御系統(tǒng)平衡的作用需要準(zhǔn)確評價不同茶葉的抗氧化性能，因此，建立用于評價抗氧化性能的簡便快速的檢測方法對于具有重要的意義。

2、目前，研究者通常使用高效液相色譜(hplc)和氣相色譜(gc)等技術(shù)來分離鑒定抗氧化活性物質(zhì)，但此類方面耗時長，且需要經(jīng)驗(yàn)豐富的操作人員。較常用的抗氧化能力檢測方法包括過氧化值法、鐵離子還原抗氧化能力測定法(frap法)、二苯基苦基苯肼(dpph)法、氧化自由基吸收能力測定(orac)法、abts[2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]法等方法，這些檢測方法原理各有不同，適用的抗氧化物質(zhì)也不同，用不同方法測量時結(jié)果也會不同。納米酶，是一種具有類天然酶催化活性的納米材料，其中，部分納米酶能夠通過模擬天然酶的活性，催化h2o2和tmb的顯色反應(yīng)。在該顯色反應(yīng)過程中涉及多種ros的產(chǎn)生，而抗氧化物質(zhì)的加入會影響該顯色反應(yīng)。因此，研究者報(bào)道了基于納米酶催化的過氧化氫(h2o2)和3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)的顯色反應(yīng)的抗氧化能力檢測方法。

3、茶葉的抗氧化活性可歸因于其含有的茶多酚。茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，其中包括兒茶素類、黃酮類和黃酮醇類等，其中兒茶素的含量占總含量的60％～80％。兒茶素中各類物質(zhì)含量不同，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(egcg)是茶多酚中的最有效的成分，占兒茶素含量50％左右。

4、目前為止，本發(fā)明提供的一種銅基金屬有機(jī)骨架納米酶未見報(bào)道，且基于納米酶的以egcg當(dāng)量評價茶葉的抗氧化能力的雙模檢測方法的研究也未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種可用于茶葉抗氧化能力檢測的納米酶，該納米酶具有多種類酶性質(zhì)，同時提供一種可用于茶葉抗氧化能力評價(egcg當(dāng)量)的雙模檢測方法，以解決現(xiàn)有抗氧化能力評價方法存在的問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、一種銅基納米酶在茶多酚抗氧化能力雙模檢測方面的應(yīng)用，包括以下步驟：

4、a.制備銅基納米酶材料；

5、b.將不同濃度的表沒食子兒茶素沒食子酸酯溶液與銅基納米酶溶液混合，然后將其加入到含有naac-hac緩沖溶液、過氧化氫和3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺溶液中，用紫外可見分光計(jì)測定其紫外吸收光譜，記錄653nm處的吸光度a653，得到653nm處的吸光度a653與表沒食子兒茶素沒食子酸酯濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

6、c.將不同濃度的表沒食子兒茶素沒食子酸酯溶液與銅基納米酶溶液混合，然后將其加入到含有naac-hac緩沖溶液、過氧化氫和3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺溶液中，激光器照射該混合溶液一定時間后用紅外熱成像儀測定其溫度，得到溫度與表沒食子兒茶素沒食子酸酯濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

7、d.將茶葉的水提取液與銅基納米酶溶液混合，然后將其加入到含有naac-hac緩沖溶液、過氧化氫和3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺溶液中，用紫外可見分光計(jì)測定其紫外吸收光譜，記錄653nm處的吸光度a653，并與步驟b得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，得到該茶葉水提取液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的當(dāng)量，進(jìn)而計(jì)算出該茶葉中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯當(dāng)量，表沒食子兒茶素沒食子酸酯當(dāng)量的值用于評價該茶葉的抗氧化能力；

8、e.將茶葉的水提取液與銅基納米酶溶液混合，通過光熱法測定溫度變化，與步驟c得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，得到該茶葉水提取液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的當(dāng)量，進(jìn)而計(jì)算出該茶葉中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯當(dāng)量，表沒食子兒茶素沒食子酸酯當(dāng)量的值用于評價該茶葉的抗氧化能力。

9、在一些實(shí)施方式中，所述步驟a中，銅基納米酶材料的制備包括以下具體步驟：

10、a1.將0.05～0.15mmol氯化銅和0.02～0.04mmol咪唑苯基卟啉溶解在5～6ml二甲基甲酰胺中制成溶液a，將0.1～0.3g聚乙烯吡咯烷酮溶解在5～6ml二甲基甲酰胺和5～6ml乙醇的混合溶液中制成溶液b，溶液b與溶液a的體積比為2.2～1.8：1，然后將溶液a與溶液b混合在一起進(jìn)行超聲震蕩得到混合溶液；

11、a2.將步驟a1制得的混合溶液密封在聚四氟乙烯高壓反應(yīng)釜中，并在80℃下保持16小時，然后將反應(yīng)系統(tǒng)冷卻至環(huán)境溫度；

12、a3.將步驟a2制得的混合溶液離心三次并用乙醇洗滌干燥，獲得紫色沉淀，室溫保存，得到片狀的銅基納米酶材料。

13、在一些實(shí)施方式中，所述步驟a3的具體操作為：將得到的混合溶液離心，用乙醇洗滌2～3次后，在60～80℃干燥24～48小時，室溫保存，得到片狀的銅基納米酶材料，且所述離心的參數(shù)如下：時間為10～15min，轉(zhuǎn)速為7000～9000rpm。

14、在一些實(shí)施方式中，所述步驟b的具體操作如下：向樣品管中加入3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺溶液、過氧化氫溶液、naac-hac緩沖溶液、銅基納米酶水溶液、表沒食子兒茶素沒食子酸酯溶液、去離子水，使反應(yīng)體系為2ml，且表沒食子兒茶素沒食子酸酯在反應(yīng)體系中的濃度分別為0μm、5μm、10μm、15μm、20μm、30μm、40μm、60μm和80μm；然后將上述溶液混合均勻，在室溫下反應(yīng)15分鐘后，利用紫外可見分光光度計(jì)檢測500～800nm的紫外可見吸收光譜，記錄653nm處的吸光度；以反應(yīng)體系中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的濃度為橫坐標(biāo)，以653nm處的吸光度為縱坐標(biāo)，得到吸光度與表沒食子兒茶素沒食子酸酯濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

15、在一些實(shí)施方式中，所述步驟c中激光器的使用波長為808nm，功率為1～2w，所述步驟c的具體操作如下：向樣品管中加入3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺溶液、過氧化氫溶液、naac-hac緩沖溶液、銅基納米酶水溶液、表沒食子兒茶素沒食子酸酯溶液、去離子水，使反應(yīng)體系為2ml，且其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯在反應(yīng)體系中的濃度分別為0μm、5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm和40μm；然后將上述溶液混合均勻，在室溫下反應(yīng)15分鐘后，利用激光器對反應(yīng)后的溶液進(jìn)行光照，光照10分鐘，通過熱成像儀得到它的紅外熱成像圖，加入不同濃度的表沒食子兒茶素沒食子酸酯所呈現(xiàn)的溫度是不同的，從而得到溫度與表沒食子兒茶素沒食子酸酯濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

16、在一些實(shí)施方式中，所述步驟d和e中茶葉的水提取液由茶葉浸泡在水中獲得，茶葉的質(zhì)量為0.05～0.15g，水的體積為90～110ml。

17、在一些實(shí)施方式中，所述步驟d的具體操作如下：向樣品管中加入3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺溶液、過氧化氫溶液、naac-hac緩沖溶液、銅基納米酶水溶液、茶葉的水提取液、去離子水，使反應(yīng)體系為2ml；然后將上述溶液混合均勻，在室溫下反應(yīng)15分鐘，利用紫外可見分光光度計(jì)檢測500～800nm的紫外可見吸收光譜，將653nm處的吸光度代入步驟b得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到2ml測試體系中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的濃度，經(jīng)計(jì)算即得茶葉的水提取液中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的當(dāng)量，進(jìn)而得到茶葉樣品中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的當(dāng)量。

18、在一些實(shí)施方式中，所述步驟e的具體操作如下：向樣品管中加入3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺溶液、過氧化氫溶液、naac-hac緩沖溶液、銅基納米酶水溶液、茶葉的水提取液、去離子水，使反應(yīng)體系為2ml；然后將上述溶液混合均勻，在室溫下反應(yīng)15分鐘后，再用激光器照射10分鐘，利用紅外熱成像儀檢測加入不同濃度后的表沒食子兒茶素沒食子酸酯的溫度變化，根據(jù)步驟c制得的表沒食子兒茶素沒食子酸酯不同濃度對應(yīng)的溫度與表沒食子兒茶素沒食子酸酯濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到2ml測試體系中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的濃度，經(jīng)計(jì)算即得茶葉的水提取液表中沒食子兒茶素沒食子酸酯的當(dāng)量，進(jìn)而得到茶葉樣品中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的當(dāng)量。

19、在一些實(shí)施方式中，過氧化氫溶液濃度為6～9mm，3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺溶液濃度為4～6mm。

20、在一些實(shí)施方式中，所述銅基納米酶水溶液濃度為15～30μg/ml，所述naac-hac緩沖溶液的濃度為9～11mm、ph為3.75～5.75。

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：cu-tipp制備簡單，egcg檢測方法簡便高效，靈敏度高，能夠表現(xiàn)出較好的應(yīng)用效果，因而對于檢測茶葉中有多少當(dāng)量的egcg，進(jìn)而判斷它的天然抗氧化性具有重要的應(yīng)用價值。