本發(fā)明屬于梅毒特異性抗體檢測，具體涉及一種梅毒螺旋體tpp17特異性抗體的檢測方法。

背景技術：

1、梅毒是由梅毒螺旋體引起的性傳播性疾病。目前，在診斷梅毒的過程中，除了詳細分析患者的流行病史和臨床特征外，實驗室檢查扮演著至關重要的角色。鑒于蒼白球絳蟲無法在人工培養(yǎng)基中培養(yǎng)，傳統(tǒng)的診斷方法如腦脊液接種兔睪丸等顯得耗時且操作復雜。此外，暗場顯微鏡雖有效但需高精尖儀器和專業(yè)技術支持。組織病理活檢和免疫熒光染色雖然可行，但因其侵入性操作和較低的敏感性而受到限制。其中，蒼白球絳蟲即梅毒螺旋體。

2、血清學檢測作為診斷梅毒不可或缺的一環(huán)，已發(fā)展出多種方法，主要分為非梅毒螺旋體試驗和梅毒螺旋體試驗。ntt主要檢測針對梅毒受損宿主細胞釋放物質(zhì)的抗體，包括性病研究實驗室試驗、快速血漿反應素試驗和甲苯胺紅無熱血清試驗。這些篩查方法成本較低，適用于廣泛篩查，但其抗原：天然心磷脂和牛心臟卵磷脂僅針對患者抗體，因此具有高敏感性但特異性相對較低，可能產(chǎn)生與其他螺旋體相關疾病的交叉反應。其中，非梅毒螺旋體試驗的英文簡稱為ntt。梅毒螺旋體試驗的英文簡稱為tts。性病研究實驗室的英文簡稱為vdrl?？焖傺獫{反應素的英文簡稱為rpr。甲苯胺紅無熱血清試驗的英文簡稱為trust。

3、tts則采用昂貴的兔感染培養(yǎng)的密螺旋體抗原來檢測特異性的密螺旋體抗體，如梅毒螺旋體顆粒凝集試驗、梅毒螺旋體血凝試驗、熒光密螺旋體抗體吸收法和化學發(fā)光免疫分析法。其中，梅毒螺旋體顆粒凝集試驗的英文簡稱為tppa。梅毒螺旋體血凝試驗的英文簡稱為tpha。熒光密螺旋體抗體吸收法的英文簡稱為fta-abs。化學發(fā)光免疫分析法的英文簡稱為cia。

4、上述這些檢測方法均存在特異性和靈敏性低的問題。

技術實現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術中現(xiàn)有的梅毒螺旋體抗體檢測方法存在特異性和靈敏性低的問題，本發(fā)明提供了一種梅毒螺旋體tpp17特異性抗體的檢測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

2、本發(fā)明提供了一種梅毒螺旋體tpp17特異性抗體的檢測方法，包括如下步驟：

3、將濃度為0.9mg/ml～1.2mg/ml的蛋白a/g修飾磁珠、tpp17-hgluc蛋白以及經(jīng)稀釋的待測血清樣本混合后，孵育10分鐘～20分鐘，得到包含抗體-tpp17-hgluc復合物的磁珠顆粒。

4、其中，所述蛋白a/g修飾磁珠、所述tpp17-hgluc蛋白和所述經(jīng)稀釋的血清樣本的體積比為1：4～6：3～5。

5、再將得到的包含抗體-tpp17-hgluc復合物的磁珠顆粒進行清洗；將清洗后的包含抗體-tpp17-hgluc復合物的磁珠顆粒釋放到hgluc緩沖液中，得到釋放后的包含抗體-tpp17-hgluc復合物的磁珠顆粒。

6、將向釋放后的包含抗體-tpp17-hgluc復合物的磁珠顆粒中加入腔腸素底物，進行生物發(fā)光強度進行測量。

7、通過對第二細胞培養(yǎng)板中不同孔中測量的生物發(fā)光強度進行比較，判斷所述待測血清樣本中梅毒抗體的存在與否及其濃度。

8、本發(fā)明提供的上述梅毒螺旋體tpp17特異性抗體的檢測方法中采用蛋白a/g固定化的磁粒來精準捕獲血清中的抗體，同時利用tpp17抗原嵌合蛋白與人源化的gaussia熒光素酶進行特異性標記，從而確保了檢測的高靈敏度和高特異性。即本發(fā)明提供的上述梅毒螺旋體tpp17特異性抗體的檢測方法解決了現(xiàn)有技術中現(xiàn)有的梅毒螺旋體抗體檢測方法存在特異性和靈敏性低的問題。其中，a/g固定化的磁粒又稱為a/g修飾磁珠。

9、優(yōu)選地，所述蛋白a/g修飾磁珠、所述tpp17-hgluc蛋白和所述經(jīng)稀釋的血清樣本在混合后，利用核酸提取機進行孵育。

10、核酸提取機進行孵育時的設定運行程序命令為：結合8分鐘～12分鐘，漂洗1.5分鐘～2.5分鐘，漂洗1.5分鐘～2.5分鐘，漂洗1.5分鐘～2.5分鐘，漂洗1.5分鐘～2.5分鐘，丟磁珠25秒～50秒。此過程洗滌孵育一體化，減少了操作時間，并且規(guī)避了人員暴露的危險。

11、優(yōu)選地，所述孵育的條件為10分鐘～20分鐘，35℃～40℃。相比于傳統(tǒng)的熒光素酶免疫共沉淀系統(tǒng)孵育時間減少了數(shù)十倍。

12、優(yōu)選地，所述包含抗體-tpp17-hgluc復合物的磁珠顆粒清洗時的方法為：先經(jīng)緩沖液a清洗，再經(jīng)hgluc緩沖液清洗。

13、所述緩沖液a的配制方法為：分別取2.2g～2.6g?tris、28g～31g氯化鈉、9ml～11ml?tritonx-100，加水溶解，調(diào)節(jié)ph值為7.2～7.6，加水定容至1l，再經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，即得。

14、所述hgluc緩沖液的配制方法為：分別取2.2g～2.6g?tris、5.5g～6.0g氯化鈉，加水溶解，調(diào)節(jié)ph值為7.2～7.6，加定容至1l，再經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，即得。

15、優(yōu)選地，所述經(jīng)稀釋的待測血清樣本為待測血清樣本經(jīng)20倍～80倍的稀釋倍數(shù)得到的。

16、優(yōu)選地，所述待測血清樣本的獲得方法為：將血液先在36℃～38℃放置1.5小時～2.5小時，再放入0℃～4℃低溫放置8小時～16小時，然后以1800rpm～3000rpm的速度離心血液4分鐘～6分鐘，吸取上層血清，獲得所述待測血清樣本。

17、優(yōu)選地，所述tpp17-hgluc蛋白的制備方法為：采用人腎上皮細胞系進行tpp17-hgluc蛋白表達，并進行超濾濃縮，獲取所述tpp17-hgluc蛋白，用哺乳動物細胞表達出的蛋白結構具有空間構象表位。

18、優(yōu)選地，所述人腎上皮細胞系為293f細胞。

19、優(yōu)選地，所述超濾濃縮的方法為：使用8kda～12kda的超濾管進行濃縮，且超濾濃縮時的轉(zhuǎn)速為3750×g～3800×g。

20、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

21、1、本發(fā)明提供了一種梅毒螺旋體tpp17特異性抗體的檢測方法，該方法巧妙地結合了熒光素酶免疫-磁分離系統(tǒng)和自動磁處理機的先進技術。在這一方法中，本發(fā)明采用蛋白a/g固定化的磁粒來精準捕獲血清中的抗體，同時利用tpp17抗原嵌合蛋白與人源化的gaussia熒光素酶進行特異性標記，從而確保了檢測的高靈敏度和高特異性。其中，熒光素酶免疫-磁分離系統(tǒng)的英文簡稱為lims。人源化的gaussia熒光素酶的英文簡稱為hgluc。a/g固定化的磁粒又稱為a/g修飾磁珠。

22、磁分離步驟在核酸提取機上自動進行，這不僅簡化了操作流程，還大大提高了檢測效率。本發(fā)明為這一步驟配備了用戶友好的自定義程序，使得整個檢測過程更加便捷和可靠。從樣品處理到結果輸出，整個分析流程僅需25分鐘，且一次可檢測多達32個樣品，充分滿足了大規(guī)模篩查和快速診斷的需求。

23、這一自動化檢測平臺展現(xiàn)出了巨大的商業(yè)化潛力，尤其是在血清中tpp17特異性抗體的檢測領域。其高效、準確、快速的特點，使得其在控制梅毒傳播方面具有重要意義。通過快速準確地檢測梅毒特異性抗體，我們能夠更早地發(fā)現(xiàn)感染者，從而采取及時有效的防控措施，阻斷梅毒的傳播鏈條，保護公共衛(wèi)生安全。

24、2、lips最初由burbelo教授針對檢測結腸癌而提出，如今已在多個關鍵領域展現(xiàn)出其卓越的應用價值。lips是一項前沿技術，它通過融合蛋白與抗原的熒光素酶標記，高效測定血清中的抗體。該技術憑借其快速和敏感的特性，已廣泛應用于呼吸道合胞病毒、人諾如病毒、自身免疫性疾病、傳染病以及sars-cov-2的抗體檢測。此外，lips的自動化潛力得以凸顯，通過引入磁性顆粒替代傳統(tǒng)的樹脂顆粒，實現(xiàn)了操作的便捷化。其中，lips的英文全稱為luciferase?immunoprecipitation?system，其中文名稱為熒光素酶免疫沉淀法系統(tǒng)。

25、本發(fā)明基于lips技術，結合蛋白a/g修飾的磁性顆粒，構建了熒光素酶免疫磁性分離系統(tǒng)。這一平臺展現(xiàn)了諸多顯著優(yōu)勢：首先，溶液中的抗原能夠以其自然的空間構象與抗體有效結合；其次，由于熒光素酶的特殊性質(zhì)，背景噪聲極低，有效提高了檢測準確性；再者，低濃度的tpp17-hgluc融合蛋白即可滿足lims的需求，無需繁瑣的純化步驟；最后，磁性顆粒的引入使得系統(tǒng)易于自動化操作。其中，熒光素酶免疫磁性分離系統(tǒng)的英文簡稱為lims。

26、所建立的lims平臺不僅具有快速、高通量的特點，而且其靈敏度超越了傳統(tǒng)的elisa方法。在臨床實踐中，該平臺已成功應用于梅毒特異性抗體的檢測。通過將磁性顆粒與簡易的磁性顆粒處理機相結合，我們實現(xiàn)了檢測過程的自動化，極大地提高了操作的便捷性和效率。因此，這一方法具有廣闊的臨床應用前景，為疾病的早期診斷和防控提供了有力的技術支持。