本發(fā)明涉及凍干，具體涉及一種凍干小球的制備方法，尤其涉及一種六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)凍干小球及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、外周血淋巴細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，主要包括t淋巴細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（nk）。外周血淋巴亞群百分比以及細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)在醫(yī)學(xué)研究和臨床檢驗(yàn)等方面具有重要的作用，了解不同情況下體內(nèi)的免疫功能狀態(tài)，輔助臨床上的疾病診斷，探索疾病發(fā)病機(jī)理、病程進(jìn)展、預(yù)后判斷及監(jiān)測和指導(dǎo)臨床治療方案。尤其在免疫學(xué)研究中，特定細(xì)胞百分比和數(shù)目是評價(jià)免疫學(xué)效應(yīng)的指標(biāo)。臨床上，淋巴細(xì)胞亞群主要通過流式細(xì)胞儀分析，流式細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)（fcm）在淋巴細(xì)胞亞群檢測中，使用多種不同熒光素標(biāo)記的白細(xì)胞表面標(biāo)記單抗對白細(xì)胞進(jìn)行熒光染色標(biāo)記，再利用流式細(xì)胞儀逐一區(qū)分每一個(gè)白細(xì)胞上的不同白細(xì)胞標(biāo)記熒光陽性模式，即可對白細(xì)胞進(jìn)行細(xì)致分類，簡便、快捷地獲得各種白細(xì)胞亞類的含量。

2、但是，目前市面上多使用液態(tài)抗體進(jìn)行淋巴亞群的檢測，并且使用的都是液態(tài)六色抗體，而液態(tài)抗體存在取液偏差等問題，因此會(huì)影響檢測的準(zhǔn)確性。而且用于流式細(xì)胞儀檢測的液態(tài)抗體，通常需要將熒光微球溶液、熒光抗體溶液、緩沖液等分開包裝，使用時(shí)再混合孵育，檢測過程繁瑣，同時(shí)液態(tài)抗體還存在對存儲和運(yùn)輸條件要求較高，保質(zhì)期不長等問題。

3、為了方便儲存、運(yùn)輸及檢測過程中更加簡便易操作，希望將液態(tài)抗體檢測試劑制備成凍干小球，直接用于流式細(xì)胞儀抗原的檢測?，F(xiàn)有技術(shù)中有使用10%蔗糖對抗人肝癌單抗片段抗體進(jìn)行凍干，凍干品性狀為白色餅塊表面呈細(xì)沙狀，顯微結(jié)構(gòu)為疏松多孔狀。然而，凍干成白色餅塊的抗體存在粘連杯壁，復(fù)溶不完全的情況。由于凍干過程中可供改變的環(huán)節(jié)很多，如多組分保護(hù)劑、預(yù)凍降溫速率、真空度等，都會(huì)影響凍干效果，因此本領(lǐng)域極需效果更佳的凍干工藝。

4、發(fā)明專利cn117159480b（一種重組人ifn-γ蛋白凍干小球及其制備方法和應(yīng)用）和cn118225545b（一種重組人tnf-α蛋白凍干小球及其制備方法和應(yīng)用），分別提供了將ifn-γ蛋白和tnf-α蛋白制備成凍干小球，可直接作為檢測檢測標(biāo)準(zhǔn)品使用，不同凍干小球間保持高度均一性，保存期達(dá)5年以上。但是這兩種凍干小球都僅僅采用一種蛋白制備，而且僅能用于標(biāo)準(zhǔn)品，無法用于細(xì)胞檢測，更無法用于六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)。

5、與標(biāo)準(zhǔn)品蛋白相比，經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)的檢測試劑通常需要包括熒光微球溶液、熒光抗體溶液、緩沖液等多種溶液，制備成凍干小球后需要保證其中所有成分的長期保存穩(wěn)定性，既要保證抗體的活性，又要保證熒光標(biāo)記與微球、抗體的結(jié)合穩(wěn)定性，還要保證緩沖液中各種成分的穩(wěn)定性，用于檢測時(shí)能提供合適的檢測環(huán)境，而且彼此間不能發(fā)生交叉影響，從而才能準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)。

6、cn118091117b（一種用于制備凍干小球的保護(hù)劑及其應(yīng)用）公開了一種可實(shí)現(xiàn)六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)的凍干小球，但是其制備的凍干小球無法長期存放，且長期存放后難以保證六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)的穩(wěn)定性。

7、因此急需找到一種六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)凍干小球，解決目前難以攻克的穩(wěn)定性問題，使其能長期存放，并且能保證長期存放后的檢測準(zhǔn)確性、靈敏度和特異性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)凍干小球及其制備方法和應(yīng)用，所述凍干小球，由熒光微球溶液、熒光抗體溶液和凍干保護(hù)溶液混合，以簡單的成分制得凍干小球。所述凍干保護(hù)溶液中含有封閉劑、聚合物、抗氧化劑、糖類、多元醇、氨基酸、表面活性劑和緩沖液，并對各組分進(jìn)行大量篩選，最終制得六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)凍干小球，其無需添加防腐劑即可長期保存，既能保證凍干小球中各成分的穩(wěn)定性，又能保證長期存放后六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，具有穩(wěn)定性好、保質(zhì)期長、使用便利等優(yōu)點(diǎn)。

2、一方面，本發(fā)明提供了一種六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)凍干小球，所述凍干小球由熒光微球溶液、熒光抗體溶液和凍干保護(hù)溶液混合成凍干原液，再凍干成球狀；所述凍干保護(hù)溶液包括封閉劑、糖類、多元醇、聚合物、抗氧化劑、表面活性劑和緩沖液；所述封閉劑包括脫脂奶粉和精氨酸；所述抗氧化劑包括l-抗壞血酸鈉與乙二胺四乙酸二鈉鹽二水；所述熒光抗體溶液中的抗體包括cd45單抗、cd3單抗、cd4單抗、cd8單抗、cd19單抗、cd16單抗和cd56單抗。

3、本發(fā)明制備的六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)凍干小球中包含了用于流式細(xì)胞檢測的所有檢測試劑，制備的凍干小球單獨(dú)分裝至流式管中，單獨(dú)包裝，用于檢測時(shí)，只需要向這個(gè)裝有凍干小球的流式管中直接添加樣本，即可通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)。而且該凍干小球不僅能夠保證其中每種試劑成分在凍干后的穩(wěn)定性和檢測活性，還能為樣品檢測時(shí)提供合適的檢測環(huán)境，為樣品的精確檢測提供保障，消除多種液態(tài)試劑移取過程帶來的批間差，最關(guān)鍵的是能夠長期存放，保質(zhì)期長達(dá)5年以上，隨取隨用，極大地簡化了檢測流程，檢測過程非常便利高效。

4、現(xiàn)有的含有熒光微球和熒光抗體的凍干小球，通常需要添加防腐劑來提高其穩(wěn)定性，但是防腐劑的加入，對長期存放后的檢測準(zhǔn)確性存在一定的影響，導(dǎo)致制備的凍干小球難以長期存放，存在較嚴(yán)重的缺陷。本發(fā)明制備的六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)凍干小球通過采用合適的封閉劑和抗氧化劑組合，使其無需添加任何防腐劑，消除了防腐劑對后期檢測的影響。

5、不同抗氧化劑對凍干小球的抗氧化效果存在顯著差異，當(dāng)采用l-抗壞血酸鈉與乙二胺四乙酸二鈉鹽二水的組合制備抗氧化劑時(shí)，其通用性更強(qiáng)，而且配方簡單，氧化效果具有協(xié)同增效，能用于多種抗體的聯(lián)合檢測，效果更優(yōu)異，從而無需添加防腐劑，不會(huì)對檢測準(zhǔn)確性帶來影響。

6、凍干小球中的氨基酸，既能起到封閉劑的效果，保證檢測的準(zhǔn)確性和特異性，又能維持凍干時(shí)ph值的變化。所述氨基酸包括脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、組氨酸、精氨酸、4羥基脯氨酸、l-絲氨酸、β-丙氨酸、鹽酸賴氨酸、賴氨酸、肌氨酸中的一種或多種，其中最優(yōu)選的氨基酸為精氨酸。

7、在一些方式中，所述聚合物包括葡聚糖、聚蔗糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉、阿拉伯樹膠、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、β-環(huán)糊精、甲基纖維素、麥芽糊精、交聯(lián)葡聚糖中的一種或多種；所述糖類包括蔗糖、葡萄糖、海藻糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、殼聚糖、甘露糖、核糖、木糖、棉子糖中的一種或多種；所述多元醇包括山梨醇、丙三醇、甘露醇、木糖醇、肌醇中的一種或多種；所述表面活性劑包括吐溫80、吐溫20、十二烷基硫酸鈉、羥丙基-β-環(huán)糊精、曲拉通x-100、蔗糖脂肪酸酯、脂肪醇聚氧乙烯醚中的一種或多種；所述緩沖液包括檸檬酸鹽緩沖液、tris-hcl緩沖液、磷酸鹽緩沖液中的一種或多種。

8、本發(fā)明制備的六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)凍干小球中，聚合物的加入能夠顯著加快溶液凍結(jié)速度，從而能顯著提高所有檢測試劑凍干后的檢測活性，提高檢測準(zhǔn)確性和靈敏度；糖類有助于保護(hù)蛋白結(jié)構(gòu)；表面活性劑能防止熒光微球聚集黏連；多元醇主要起到填充劑的作用，也有助于提高蛋白的穩(wěn)定性。

9、凍干小球中的緩沖液不僅要為凍干小球中各成分提供穩(wěn)定的凍干環(huán)境，還要為所有檢測試劑組合用于檢測時(shí)提供合適的檢測環(huán)境，從而保證流式細(xì)胞儀檢測過程的順利進(jìn)行。

10、進(jìn)一步地，所述聚合物包括聚蔗糖；所述糖類包括海藻糖和核糖；所述抗氧化劑包括l-抗壞血酸鈉與乙二胺四乙酸二鈉鹽二水；所述多元醇包括木糖醇；所述表面活性劑包括羥丙基-β-環(huán)糊精；所述緩沖液包括磷酸鹽緩沖液。

11、不同聚合物、糖類、抗氧化劑、多元醇、表面活性劑及緩沖液對制備凍干小球的效果具有顯著差異，本發(fā)明經(jīng)大量篩選，獲得最簡單并且效果最佳的聚合物、糖類、抗氧化劑、多元醇、氨基酸、表面活性劑及緩沖液的配方。

12、進(jìn)一步地，按照質(zhì)量百分比計(jì)，所述凍干保護(hù)溶液包括脫脂奶粉0.1~2%、聚蔗糖1~5%、l-抗壞血酸鈉0.1~1%、乙二胺乙酸二鈉鹽二水0.1~1%、海藻糖1~10%、核糖0.5~5%、木糖醇2~8%、精氨酸0.5~3%、聚蔗糖1~5%、磷酸鹽緩沖液0.005~1mol/l。

13、在一些方式中，按照質(zhì)量百分比計(jì)算，所述凍干保護(hù)溶液包括脫脂奶粉1%、聚蔗糖3%、l-抗壞血酸鈉0.5%、乙二胺乙酸二鈉鹽二水0.5%、海藻糖5%、核糖1%、木糖醇1%、精氨酸1%、羥丙基-β-環(huán)糊精0.5%、磷酸鹽緩沖液0.01mol/l。

14、進(jìn)一步地，所述熒光微球溶液、熒光抗體溶液與凍干保護(hù)溶液的體積比為(1~5):(2~10):(2~10)。

15、在一些方式中，所述熒光微球溶液、熒光抗體溶液與凍干保護(hù)溶液的體積比為1:2:2。

16、進(jìn)一步地，所述凍干原液的ph為7.0~7.4。

17、凍干原液的ph，對于本發(fā)明提供的用于抗原檢測的凍干小球同樣存在比較關(guān)鍵的影響，因?yàn)椴粌H關(guān)系到凍干穩(wěn)定性的效果，還關(guān)系到樣品檢測的準(zhǔn)確性，必須選擇出最合適的ph值，才能既保證其中每種試劑成分在凍干后的穩(wěn)定性和檢測活性，還能為樣品檢測時(shí)提供合適的檢測環(huán)境。

18、進(jìn)一步地，所述熒光抗體溶液中的抗體包括：克隆號為2d1的percp-cy5.5-cd45單抗、克隆號為sk7的fitc-cd3單抗、克隆號為sk3的pe-cy7-cd4單抗、克隆號為sk1的apc-cy7-cd8單抗、克隆號為sj25-c1的apc-cd19單抗、克隆號為b73.1的pe-cd16單抗、克隆號為5.1h11的pe-cd56單抗。

19、不同克隆號的單抗，經(jīng)抗體滴定評估其在流式細(xì)胞術(shù)中的性能表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在染色指數(shù)方面存在明顯區(qū)別，分群明顯程度不同，與細(xì)胞表面的抗原結(jié)合能力也不同。因此本發(fā)明對不同克隆號的單抗進(jìn)行篩選，從中挑選出具有最佳染色效果的單抗用于制備偶聯(lián)抗體的微球溶液和帶有標(biāo)記的抗體溶液，并制備成凍干小球。

20、進(jìn)一步地，所述熒光微球?yàn)樘K州為度公司的熒光計(jì)數(shù)微球。

21、另一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測抗原含量的凍干小球的制備方法，所述方法包括以下步驟：

22、（1）配制熒光抗體溶液，所述抗體包括cd45單抗、cd3單抗、cd4單抗、cd8單抗、cd19單抗、cd16單抗和cd56單抗；

23、（2）配制凍干保護(hù)溶液：取脫脂奶粉、精氨酸、聚蔗糖、海藻糖、核糖、l-抗壞血酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉鹽二水、木糖醇、羥丙基-β-環(huán)糊精和磷酸鹽緩沖液，配制成凍干保護(hù)溶液；

24、（3）取凍干保護(hù)溶液、熒光微球溶液和熒光抗體溶液混合成凍干原液；

25、（4）通過滴珠設(shè)備將凍干原液滴至液氮中，凍結(jié)形成球體狀凍珠；

26、（5）通過冷凍干燥工藝將凍珠制備成用于檢測抗原含量的凍干小球。

27、進(jìn)一步地，步驟（1）所述熒光抗體溶液的抗體包括：所述cd45單抗為克隆號為2d1的percp-cy5.5-cd45單抗；所述cd3單抗為克隆號為sk7的fitc-cd3單抗；所述cd4單抗為克隆號為sk3的pe-cy7-cd4單抗；所述cd8單抗為克隆號為sk1的apc-cy7-cd8單抗；所述cd19單抗為克隆號為sj25-c1的apc-cd19單抗；所述cd16單抗為克隆號為b73.1的pe-cd16單抗；所述cd56單抗為克隆號為5.1h11的pe-cd56單抗。

28、進(jìn)一步地，步驟（5）所述冷凍干燥工藝包括以下過程：

29、b-1：將擱板的溫度設(shè)置為-50℃，并保持該溫度2h；

30、b-2：將擱板的溫度設(shè)置為-50℃，并對冷凍干燥機(jī)抽真空（真空度小于20?pa）后保持該溫度4.5h；

31、b-3：將擱板的溫度設(shè)置為-40℃，并保持該溫度10h；

32、b-4：將擱板的溫度設(shè)置為-30℃，并保持該溫度10h；

33、b-5：將擱板的溫度設(shè)置為-20℃，并保持該溫度10h；

34、b-6：將擱板的溫度設(shè)置為-10℃，并保持該溫度1h；

35、b-7：將擱板的溫度設(shè)置為0℃，并保持該溫度1h；

36、b-8：將擱板的溫度設(shè)置為10℃，并保持該溫度1h；

37、b-9：將擱板的溫度設(shè)置為25℃，并保持該溫度2-8h。

38、研究證明，采用該程序進(jìn)行冷凍干燥，能降低六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)凍干小球的含水量，改善外觀，提高分群效果，有利于提高六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。

39、再一方面，本發(fā)明提供了一種六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)方法，所述方法采用如上所述的凍干小球進(jìn)行檢測。

40、再一方面，本發(fā)明提供了一種凍干保護(hù)溶液，所述凍干保護(hù)溶液包括封閉劑、糖類、多元醇、聚合物、抗氧化劑、表面活性劑和緩沖液；其中，封閉劑包括脫脂奶粉和精氨酸，聚合物包括聚蔗糖，糖類包括海藻糖和核糖，抗氧化劑包括l-抗壞血酸鈉與乙二胺四乙酸二鈉鹽二水，多元醇包括木糖醇，氨基酸包括精氨酸，表面活性劑包括羥丙基-β-環(huán)糊精，緩沖液包括磷酸鹽緩沖液。

41、再一方面，本發(fā)明提供了一種凍干保護(hù)溶液用于制備提高六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)凍干小球的檢測穩(wěn)定性的試劑的用途，所述凍干保護(hù)溶液包括封閉劑、糖類、多元醇、聚合物、抗氧化劑、表面活性劑和緩沖液；其中，封閉劑包括脫脂奶粉和精氨酸，聚合物包括聚蔗糖，糖類包括海藻糖和核糖，抗氧化劑包括l-抗壞血酸鈉與乙二胺四乙酸二鈉鹽二水，多元醇包括木糖醇，氨基酸包括精氨酸，表面活性劑包括羥丙基-β-環(huán)糊精，緩沖液包括磷酸鹽緩沖液。

42、再一方面，本發(fā)明提供了一種凍干保護(hù)溶液用于制備提高六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)凍干小球的檢測準(zhǔn)確性和重復(fù)性的試劑的用途，所述六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)檢測包括cd45單抗、cd3單抗、cd4單抗、cd8單抗、cd19單抗、cd16單抗和cd56單抗的檢測；所述凍干保護(hù)溶液包括封閉劑、糖類、多元醇、聚合物、抗氧化劑、表面活性劑和緩沖液；其中，封閉劑包括脫脂奶粉和精氨酸，聚合物包括聚蔗糖，糖類包括海藻糖和核糖，抗氧化劑包括l-抗壞血酸鈉與乙二胺四乙酸二鈉鹽二水，多元醇包括木糖醇，氨基酸包括精氨酸，表面活性劑包括羥丙基-β-環(huán)糊精，緩沖液包括磷酸鹽緩沖液。

43、再一方面，本發(fā)明提供了一種凍干保護(hù)溶液用于制備無需防腐劑的六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)凍干小球的用途，所述六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)凍干小球包括熒光微球溶液、熒光抗體溶液和凍干保護(hù)溶液；所述凍干保護(hù)溶液包括封閉劑、糖類、多元醇、聚合物、抗氧化劑、表面活性劑和緩沖液；其中，封閉劑包括脫脂奶粉和精氨酸，聚合物包括聚蔗糖，糖類包括海藻糖和核糖，抗氧化劑包括l-抗壞血酸鈉與乙二胺四乙酸二鈉鹽二水，多元醇包括木糖醇，氨基酸包括精氨酸，表面活性劑包括羥丙基-β-環(huán)糊精，緩沖液包括磷酸鹽緩沖液。

44、相對于現(xiàn)有產(chǎn)品，本發(fā)明具有以下有益效果：

45、（1）提供了一種六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)凍干小球的，其中包含熒光抗體和熒光微球，既能保證凍干小球中各成分的穩(wěn)定性，又能保證精準(zhǔn)檢測，成分簡單、易于配制、便于使用，且長期保存，經(jīng)長期保存后依然能保證六色淋巴亞群絕對計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性、批間精密度；

46、（2）通過組分選擇、濃度優(yōu)化，使得制備得到的凍干小球外觀狀態(tài)光滑平整；用于檢測血液樣本中淋巴亞群各組分百分比以及細(xì)胞濃度時(shí)，分群效果更好，并且準(zhǔn)確度和精密度高；

47、（3）用于六色淋巴亞群細(xì)胞百分比及細(xì)胞濃度的絕對計(jì)數(shù)等，具有無需添加防腐劑、穩(wěn)定性好、保質(zhì)期長、使用便利等優(yōu)點(diǎn)；

48、（4）制備得到的凍干小球便于運(yùn)輸、儲存，又能保持生物性能穩(wěn)定，提供了一種非常理想的保存方案；

49、（5）利用本發(fā)明的保護(hù)劑制備包含熒光抗體和熒光微球的凍干小球，可以避免液態(tài)取液誤差，導(dǎo)致的檢測結(jié)果的偏差，而且小球也不會(huì)與容器內(nèi)壁粘連，避免粉末狀凍干品復(fù)溶不完全，混合不均勻的情況；

50、（6）利用本發(fā)明的保護(hù)劑制備包含熒光抗體和熒光微球的凍干小球，可以快速、簡便地檢測出淋巴亞群的百分比以及細(xì)胞數(shù)量。