本發(fā)明公開了一種細菌莢膜多糖或其結(jié)合物樣品中各單糖組分含量、多糖含量的檢測方法，屬于生物制品檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、在多糖及多糖蛋白結(jié)合疫苗的質(zhì)量控制中，對各血清型多糖的單糖組成分析是其結(jié)構(gòu)表征和質(zhì)量控制重要項目之一。目前，多糖中各單糖組分的定量檢測方法包括以下幾種類型：

2、（1）化學(xué)顯色法

3、多糖中某些特征性組分在特定波長范圍內(nèi)具有光吸收，或經(jīng)化學(xué)處理后，形成具有光吸收的物質(zhì)，其吸光值大小與含量有相關(guān)關(guān)系，可用于含量檢測。如1、3、5、9v血清型的糖醛酸，4、5、9v、14血清型的氨基已糖，6b、7f、18c、23f血清型的甲基戊糖和1型的o-乙?；?，均可在一定條件下形成有紫外吸收的物質(zhì)，進而測定其含量。該方法的局限性在于，該方法靈敏度較低，且受其它物質(zhì)的干擾較大，另外該方法只能測定某一特征性官能團含量，無法充分表征各單糖組成成分，且有些多糖不含上述特征官能團。

4、（2）高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法（hpaec-pad）

5、陰離子色譜法常用于單糖、雙糖、寡糖、多糖的分析。例如，6a型肺炎球菌莢膜多糖，經(jīng)酸水解處理后，產(chǎn)生d-葡萄糖、d-半乳糖、l-鼠李糖、d-核糖醇4種單糖組分，采用hpaec-pad法可同時測定4種單糖組分的含量。該方法具有簡單、快速、靈敏度高、不需要衍生化的優(yōu)點，但局限性在于，肺炎球菌莢膜多糖大部分血清型單糖組成成分復(fù)雜，特別是對于含氨基已糖和糖醛酸的樣品，難以實現(xiàn)各單糖組分的基線分離，同時對于結(jié)合物載體蛋白水解產(chǎn)生的氨基酸會對檢測產(chǎn)生一定的干擾作用，且該方法以強堿性溶液為流動相，需要專用的離子色譜儀，對試劑和環(huán)境要求高。

6、（3）氣相色譜法

7、氣相色譜法也是一種常用的糖類化合物含量檢測方法，具有選擇性好、樣品用量少、分辨率高、靈敏度高等優(yōu)點，但由于糖類物質(zhì)通常含有nh、oh、sh等極性基團，這些基團的內(nèi)氫鍵作用增強了分子內(nèi)部的吸引力，使得一般糖和糖醇具有沸點高、揮發(fā)性低、難氣化、穩(wěn)定性差等特點，采用gc分析時，通常需進行衍生化處理如甲基化、?；?、三甲基硅醚化等使糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橐讚]發(fā)的物質(zhì)，操作過程繁瑣，實驗要求較高，且經(jīng)過衍生物的單糖組分會產(chǎn)生異構(gòu)體，每個單糖組分衍生化后會產(chǎn)生兩個甚至多個色譜峰，對定量產(chǎn)生一定的干擾。

8、（4）柱前衍生化高效液相色譜法

9、柱前衍生化的方法主要是使糖鏈帶上紫外或熒光基團，提高檢測的靈敏度，同時又可以使糖鏈帶上疏水基團，降低糖鏈的極性，使糖鏈在反相色譜柱上得到保留，便于糖鏈的分離。常利用糖鏈的還原端與衍生化試劑如2-氨基吡啶(2-ap)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)、酰肼類化合物等反應(yīng)生成單糖衍生物，再經(jīng)反相色譜柱進行分離檢測。pmp作為還原性糖的最好衍生化試劑之一，在堿性條件下能與單糖定量縮合生成單糖-pmp衍生物，該衍生物不易裂解及產(chǎn)生異構(gòu)峰并在245nm波長處有強吸收，因此常用于食品、藥品、環(huán)境中糖類化合物的檢測。

10、各血清型莢膜多糖的單糖組成是肺炎球菌莢膜多糖疫苗和結(jié)合疫苗生產(chǎn)過程中關(guān)鍵的質(zhì)量屬性之一，不僅可以用于定性判斷特異血清型多糖的結(jié)構(gòu)是否有誤，還可用于定量計算各單糖組分含量進而計算出多糖含量。因此，針對各型別莢膜多糖的單糖組分檢測具有重要意義。然而，由于肺炎球菌莢膜多糖血清型較多，且多糖結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，差異性大，存在多糖水解困難、單糖組分易降解、液相色譜中各單糖組分難以實現(xiàn)基線分離等問題，對肺炎球菌莢膜多糖或其結(jié)合物中的單糖組成的系統(tǒng)檢測方法還鮮有報道?，F(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于如何檢測肺炎球菌多糖的含量（例如cn106018832b、cn112179859a）、多糖分子大?。ɡ鏲n113433122a）存在少量報道，但關(guān)于如何系統(tǒng)、全面、準確地檢測各型別莢膜多糖的單糖組分，還未見報道。

11、相近技術(shù)領(lǐng)域中，有報道用陰離子色譜法檢測腦膜炎球菌莢膜多糖唾液酸含量以及其它植物多糖含量的方法，也有用pmp柱前衍生化高效液相色譜法來分析檢測枸杞、真菌、川牛膝等食品和藥用植物的單糖組成，然而，還未見報道將pmp柱前衍生化高效液相色譜法用于細菌莢膜多糖的單糖組分檢測，且已報道的檢測方法中只是針對少數(shù)3-5種單糖組分的檢測。并且，由于（1）細菌莢膜多糖與藥用植物多糖的結(jié)構(gòu)、分子量等方面差別較大，適用于植物或食物多糖的檢測方法未必適用于細菌莢膜多糖，（2）肺炎球菌莢膜多糖存在數(shù)十種血清型，pmp柱前衍生化高效液相色譜法是否能夠全面檢測各血清型同時對其加以區(qū)分，仍然未知，（3）尤其是，莢膜多糖結(jié)合物（綴合物）樣品中還存在載體蛋白帶來的干擾，鑒于以上困難，本領(lǐng)域技術(shù)人員也無法合理預(yù)期pmp柱前衍生化高效液相色譜法是否適用于細菌莢膜多糖的單糖組分檢測。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述問題，本發(fā)明首次提出采用pmp柱前衍生化hplc法測定肺炎球菌莢膜多糖或其結(jié)合物中的單糖組成及含量。首先，針對不同血清型多糖之間的結(jié)構(gòu)差異，采用不同的酸水解方法（針對含糖醛酸的多糖或結(jié)合物樣品：采用“無水hcl/meth+三氟乙酸”二步酸水解方法；針對含磷酸二酯鍵的樣品：采用“氫氟酸+三氟乙酸”二步酸水解方法；針對不包含上述二者的樣品：采用三氟乙酸一步酸水解方法），以最大程度斷裂糖苷鍵釋放各單糖組分，同時盡可能降低各單糖在酸性條件下的降解；然后，水解后的單糖在堿性條件下和pmp衍生化反應(yīng)，根據(jù)各單糖標(biāo)準品出峰時間的差異，以各單糖標(biāo)準品混合物不同濃度樣品建立標(biāo)準曲線，進而獲得待測物中各單糖組成成分及其含量（濃度）；最后，基于所測樣品中特征性單糖的含量檢測結(jié)果，還可進一步計算樣品中的多糖含量。因此，本發(fā)明提供了細菌莢膜多糖或其與載體蛋白的結(jié)合物（簡稱結(jié)合物，或綴合物）樣品中各單糖組分含量的檢測方法、多糖含量檢測方法，所適用的細菌類型包括但不限于革蘭氏陽性菌，例如肺炎球菌。

2、本發(fā)明提供的具體技術(shù)方案包括如下內(nèi)容：

3、本發(fā)明提供一種細菌莢膜多糖或者細菌莢膜多糖與載體蛋白結(jié)合物樣品中各單糖組分含量的檢測方法，其包括如下步驟：

4、1）樣品水解：根據(jù)待測樣品多糖結(jié)構(gòu)中是否包含糖醛酸或磷酸二酯鍵，采用選自如下a)~c)的方式斷裂相連的糖苷鍵以釋放出各單糖組分：

5、a)不含糖醛酸也不含磷酸二酯鍵的樣品：采用三氟乙酸水解；

6、b)含糖醛酸的樣品：先采用無水氯化氫-甲醇溶液處理，然后采用三氟乙酸水解；

7、c)含磷酸二酯鍵的樣品：先采用氫氟酸處理，然后采用三氟乙酸水解；

8、2）衍生化反應(yīng)：將水解后的樣品吹干，加水溶解，然后在堿性條件下與1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（pmp）反應(yīng)生成帶紫外吸收的單糖衍生物，加鹽酸中和后，用有機溶劑進行萃取除去多余的pmp；

9、3）液相色譜檢測：根據(jù)標(biāo)準單糖的出峰時間確定樣品各單糖組成成分（單糖組分），依據(jù)外標(biāo)法定量，將單糖組分峰面積代入各單糖標(biāo)準曲線，計算各單糖組成成分的含量。

10、針對步驟1），水解方式a)~c)分別可采用如下具體操作：

11、a)?不含糖醛酸也不含磷酸二酯鍵的樣品：吹干樣品，加入2-4mol/l三氟乙酸，100-120℃水解2-4h（其中，所述“吹干”，可以采用氮氣吹干儀或真空離心濃縮儀吹干樣品，下同）；

12、b)?含糖醛酸的樣品：吹干樣品，加入2-4mol/l無水氯化氫-甲醇溶液，70-90℃水浴12-24h，然后吹干，加入2-4mol/l?三氟乙酸，100-120℃繼續(xù)水解2-4h；

13、c)?含磷酸二酯鍵的樣品：吹干樣品，加入40-50%（v/v）氫氟酸溶液，60-80℃水浴2-4h，然后吹干，加入2-4mol/l三氟乙酸后，100-120℃繼續(xù)水解2-4h；

14、針對步驟2），優(yōu)選的實施方式包括如下操作：pmp濃度0.4-0.6mol/l，氫氧化鈉濃度0.3-0.5mol/l，反應(yīng)溫度60-80℃，反應(yīng)時間30-90min；鹽酸濃度和氫氧化鈉濃度保持一致；有機溶劑可以選自：三氯甲烷（氯仿）、甲苯、乙酸異戊酯、正已烷。

15、針對步驟3），優(yōu)選的液相色譜分析實施方式如下：采用dad二級管陣列檢測器或紫外檢測器，檢測波長240-250nm，優(yōu)選245nm，進樣量10-50μl，流速0.8-1.2ml/min，流動相a：10-100mm醋酸銨緩沖液，流動相b：乙腈溶液，梯度溶液洗脫；其中，所述醋酸銨緩沖液的ph選擇5.5-6.0，優(yōu)選5.5-5.7；其中，梯度溶液洗脫優(yōu)選操作如下：隨著洗脫時間0→25min→50min→51min→60min，流動相b的濃度梯度：20%→20%→30%→20%→20%（體積百分比），余量為流動相a，二者體積合計100%。

16、針對步驟3），優(yōu)選的單糖含量計算公式為ci=(y-b)/a×d，其中：

17、ci：待測樣品某特征性單糖組分的含量，單位μg/ml；

18、y：待測樣品某特征性單糖組分液相檢測峰面積，單位mau*s；

19、a：依據(jù)特征性單糖標(biāo)準品不同濃度和峰面積所建立標(biāo)準曲線的斜率；

20、b：依據(jù)特征性單糖標(biāo)準品不同濃度和峰面積所建立標(biāo)準曲線的截距；

21、d：稀釋因子，即待測的樣品溶液被稀釋的倍數(shù)。

22、本發(fā)明適用的單糖可以選自以下的一種或多種：d-葡萄糖、d-半乳糖、l-鼠李糖、d-甘露糖、l-巖藻糖、d-葡萄糖醛酸、d-半乳糖醛酸、d-n-乙?；咸烟前?、d-n-乙?；肴樘前?、d-n-乙?；事短前贰-n-乙?；鶐r藻糖胺。

23、可選的，針對凍干樣品，在步驟1）之前，先加水溶解樣品，并將其稀釋至50-500μg/ml；優(yōu)選的，將其稀釋至200±100μg/ml。

24、本發(fā)明所適用的細菌包括但不限于革蘭氏陽性菌，例如肺炎球菌。肺炎球菌莢膜多糖或其結(jié)合物，包括但不限于1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f和33f型肺炎球菌莢膜多糖及其與載體蛋白的單價或多價結(jié)合物，載體蛋白選自但不限于crm197、白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素等，多糖和蛋白的結(jié)合采用但不限于溴化氰、cdap法等。針對肺炎球菌莢膜多糖或其結(jié)合物，所述不含糖醛酸也不含磷酸二酯鍵的樣品，選自以下血清型肺炎球菌莢膜多糖或其結(jié)合物中的一種或多種：4、7f、12f、14、17f、33f血清型；所述含糖醛酸的樣品，選自以下血清型肺炎球菌莢膜多糖或其結(jié)合物中的一種或多種：1、2、3、5、8、9n、9v、22f血清型；所述含磷酸二酯鍵的樣品，選自以下血清型肺炎球菌莢膜多糖或其結(jié)合物中的一種或多種：6a、6b、10a、11a、15b、18c、19a、19f、20、23f血清型。

25、本發(fā)明還提供細菌莢膜多糖或者細菌莢膜多糖與載體蛋白結(jié)合物樣品中莢膜多糖含量的檢測方法，其包括如下步驟：

26、s1）根據(jù)待測樣品中莢膜多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，選取特征性單糖并確定其在該莢膜多糖中所占的質(zhì)量百分比，以“wi”表示；

27、s2）按照前述單糖組分含量的檢測方法，檢測待測樣品中所述特征性單糖的組分含量，以“ci”表示；

28、s3）基于測得的特征性單糖組分含量，計算莢膜多糖的含量，公式為：ci/wi。

29、上述多糖含量檢測方法適用的細菌也包括但不限于革蘭氏陽性菌，例如肺炎球菌。針對肺炎球菌，關(guān)于步驟s1）中特征性單糖的選取，具體可以參考下文中的表4。

30、本發(fā)明的有益技術(shù)效果：

31、本發(fā)明采用pmp柱前衍生化高效液相色譜法檢測細菌莢膜多糖及結(jié)合物樣品水解后的各單糖組分及含量，針對不同血清型莢膜多糖結(jié)構(gòu)的不同及水解的難易，提出三種不同的水解方法，能夠有效水解各型肺炎球菌莢多糖，以最大程度斷裂糖苷鍵釋放各單糖組分，同時盡可能降低各單糖在酸性條件下的降解，使各單糖組分保證最大的回收率，且至少保證一種單糖組分獲得近似100%的回收率來計算多糖的含量。

32、本發(fā)明對水解后的單糖樣品檢測采用了柱前衍生化操作，一方面，可以避免載體蛋白水解過程中產(chǎn)生的氨基酸干擾，因而除了多糖樣品也適用用于多糖蛋白結(jié)合物樣品中各單糖組成成分及含量的檢測，另一方面，能夠克服離子色譜需要特殊的儀器設(shè)備及分離效果差的缺點，僅需常規(guī)的c18反相色譜柱及配套液相色譜儀即可完成檢測，同時對洗脫條件進行優(yōu)化，在一次檢測中可同時分離出中性單糖、酸性單糖和堿性單糖共計10個單糖組分，且方法學(xué)驗證的線性、精密度、準確度等均符合要求。

33、本發(fā)明提供的方法廣泛適用于細菌多糖及多糖蛋白結(jié)合物樣品中各單糖組分分離鑒定及單糖、多糖含量的檢測，為多糖疫苗及多糖蛋白結(jié)合疫苗生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制提供了可靠依據(jù)，尤其適用于肺炎球菌莢膜多糖疫苗及結(jié)合物疫苗的檢測。