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細(xì)菌莢膜多糖或其結(jié)合物中各單糖組分含量的檢測方法與流程

文檔序號:40655315發(fā)布日期:2025-01-10 19:05閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種細(xì)菌莢膜多糖或者細(xì)菌莢膜多糖與載體蛋白結(jié)合物樣品中各單糖組分含量的檢測方法,其特征在于,所述的方法包括如下步驟:

2.如權(quán)利要求1所述的檢測方法,其特征在于,步驟1)中樣品水解方式a)具體包括如下操作:吹干樣品,加入2-4mol/l三氟乙酸,100-120℃水解2-4h。

3.如權(quán)利要求1所述的檢測方法,其特征在于,步驟1)中樣品水解方式b)具體包括如下操作:吹干樣品,加入2-4mol/l無水氯化氫-甲醇溶液后,70-90℃水浴12-24h,然后吹干,加入2-4mol/l三氟乙酸,100-120℃繼續(xù)水解2-4h。

4.如權(quán)利要求1所述的檢測方法,其特征在于,步驟1)中樣品水解方式c)具體包括如下操作:吹干樣品,加入40-50%(v/v)氫氟酸溶液后,60-80℃水浴2-4h,然后吹干,加入2-4mol/l三氟乙酸,100-120℃繼續(xù)水解2-4h。

5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的檢測方法,其特征在于,步驟2)中衍生化反應(yīng)采用如下條件:pmp濃度0.4-0.6mol/l,氫氧化鈉濃度0.3-0.5mol/l,反應(yīng)溫度60-80℃,反應(yīng)時(shí)間30-90min,鹽酸濃度和氫氧化鈉濃度保持一致。

6.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的檢測方法,其特征在于,步驟2)中用于萃取的有機(jī)溶劑任選自以下的一種或多種:三氯甲烷、甲苯、乙酸異戊酯、正已烷。

7.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的檢測方法,其特征在于,步驟3)中液相色譜分析采用如下條件:采用dad二級管陣列檢測器或紫外檢測器,檢測波長240-250nm,進(jìn)樣量10-50μl,流速0.8-1.2ml/min,流動相a:10-100mm醋酸銨緩沖液,其ph?5.5-6.0,流動相b:乙腈溶液,進(jìn)行梯度溶液洗脫。

8.如權(quán)利要求7所述的檢測方法,其特征在于,步驟3)中所述梯度溶液洗脫具體如下:隨著洗脫時(shí)間0→25min→50min→51min→60min,流動相b的濃度梯度:20%→20%→30%→20%→20%,相應(yīng)流動相a的濃度梯度:80%→80%→70%→80%→80%。

9.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的檢測方法,其特征在于,步驟3)中的單糖含量計(jì)算公式如下:

10.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的檢測方法,其特征在于,所述的單糖選自以下的一種或多種:d-葡萄糖、d-半乳糖、l-鼠李糖、d-甘露糖、l-巖藻糖、d-葡萄糖醛酸、d-半乳糖醛酸、d-n-乙?;咸烟前?、d-n-乙酰基半乳糖胺、d-n-乙酰基甘露糖胺、l-n-乙?;鶐r藻糖胺。

11.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的檢測方法,其特征在于,針對凍干樣品,在步驟1)之前,先加水溶解樣品,并將其稀釋至50-500μg/ml。

12.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的檢測方法,其特征在于,所述細(xì)菌選自革蘭氏陽性菌。

13.如權(quán)利要求12所述的檢測方法,其特征在于,所述革蘭氏陽性菌選自肺炎球菌。

14.如權(quán)利要求13所述的檢測方法,其特征在于,所述不含糖醛酸也不含磷酸二酯鍵的樣品,選自以下血清型肺炎球菌莢膜多糖或其結(jié)合物中的一種或多種:4、7f、12f、14、17f、33f血清型。

15.如權(quán)利要求13所述的檢測方法,其特征在于,所述含糖醛酸的樣品,選自以下血清型肺炎球菌莢膜多糖或其結(jié)合物中的一種或多種:1、2、3、5、8、9n、9v、22f血清型。

16.如權(quán)利要求13所述的檢測方法,其特征在于,所述含磷酸二酯鍵的樣品,選自以下血清型肺炎球菌莢膜多糖或其結(jié)合物中的一種或多種:6a、6b、10a、11a、15b、18c、19a、19f、20、23f血清型。

17.細(xì)菌莢膜多糖或者細(xì)菌莢膜多糖與載體蛋白結(jié)合物中多糖含量的檢測方法,其特征在于,包括如下步驟:

18.如權(quán)利要求17所述的檢測方法,其特征在于,所述細(xì)菌選自革蘭氏陽性菌。

19.如權(quán)利要求18所述的檢測方法,其特征在于,所述革蘭氏陽性菌選自肺炎球菌。

20.如權(quán)利要求19所述的檢測方法,其特征在于,基于肺炎球菌的具體血清型,所述步驟s1)采用選自以下a)~w)中的一種或多種實(shí)施方式:


技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種細(xì)菌莢膜多糖或其結(jié)合物中各單糖組分含量的檢測方法,屬于生物制品檢測領(lǐng)域。本發(fā)明以肺炎球菌為例,針對不同血清型莢膜多糖采用不同水解方法,經(jīng)水解斷裂相連糖苷鍵,釋放出的各單糖組分在堿性條件下與1?苯基?3?甲基?5?吡唑啉酮衍生化生成帶有紫外吸收的衍生物,隨后通過液相色譜檢測多糖水解產(chǎn)生的各單糖組成及其含量。該方法可快速有效地水解出各單糖組分,同時(shí)采用衍生化的方法可分離檢測不同結(jié)構(gòu)特征的各型多糖,不僅可以定性分析各血清型多糖的單糖組成是否與理論結(jié)構(gòu)相符,也可定量測定各單糖組分含量進(jìn)而推算出多糖含量,為細(xì)菌性疫苗抗原成分莢膜多糖的質(zhì)量控制提供更好的技術(shù)支撐。

技術(shù)研發(fā)人員:周祥玉,張敬武,秦宏博,吳海燕,廖常如,唐亮,段夢奇,雷小鳳,陳建民,柴晶
受保護(hù)的技術(shù)使用者:復(fù)星安特金(成都)生物制藥有限公司
技術(shù)研發(fā)日:
技術(shù)公布日:2025/1/9
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