一種多粒徑空氣顆粒物攜帶微生物的群落監(jiān)測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多粒徑空氣顆粒物攜帶微生物的群落監(jiān)測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]霧霾是一種天氣現(xiàn)象，在自然界中也會發(fā)生，但發(fā)生的頻率很低。由于人類活動的影響，大氣氣溶膠細粒子污染日趨嚴(yán)重，霧霾天氣越來越頻繁。目前針對污染空氣及霧霾現(xiàn)象已經(jīng)有不少研宄，主要集中在氣溶膠的分析、污染空氣的源解析以及大氣污染模型的構(gòu)建等方面，針對污染空氣中微生物群落結(jié)構(gòu)組成分析和影響微生物群落結(jié)構(gòu)因素的研宄并不多。已有研宄表明，空氣中顆粒物所攜帶的微生物和人類的活動與健康有著密不可分的關(guān)系，這些微生物中的病原體和致敏菌會造成人們在霧霾天氣中易感染呼吸道疾病和過敏性等疾病，因而探明霧霾空氣中不同微生物群落結(jié)構(gòu)組成及主要影響因素，對探尋合適病原微生物控制方法，提高空氣質(zhì)量，保障居民身體健康具有重要的指導(dǎo)意義。
[0003]空氣微生物的研宄方法分為兩大類:培養(yǎng)方法和非培養(yǎng)方法。培養(yǎng)法是傳統(tǒng)的空氣微生物檢測方法，將采集的微生物經(jīng)過培養(yǎng)繁殖生長成菌落后計數(shù)，然后進行分離、純化和鑒定，確定為何種微生物。培養(yǎng)法需花費大量的時間和精力，但只能檢測可以在特定培養(yǎng)基及特定培養(yǎng)條件下生長的微生物，因此通過培養(yǎng)法只能檢測空氣中很少部分的微生物。本發(fā)明在群落分析方面采用高通量測序技術(shù)，可以檢測樣品中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的所有微生物，大大提升了樣品中微生物的檢出率和靈敏度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)空氣微生物監(jiān)測中培養(yǎng)法耗時長及檢測覆蓋面小的缺點，提供一種快速及檢出率高的多粒徑空氣顆粒物攜帶微生物的群落監(jiān)測方法。
[0005]一種多粒徑空氣顆粒物攜帶微生物的群落監(jiān)測方法的步驟如下:
1)儀器準(zhǔn)備，準(zhǔn)備采樣儀及配件，所用器皿與物品要無菌處理；
2)樣品采集，利用氣泵使空氣通過采樣儀采樣口上的無菌玻璃纖維濾膜，截留攜帶有微生物的顆粒物；
3)樣品轉(zhuǎn)移，將無菌玻璃纖維濾膜上攜帶有微生物的顆粒物轉(zhuǎn)移至0.22 μ m孔徑、直徑47mm的聚四氟乙烯濾膜上；
4)DNA提取，提取聚四氟乙烯濾膜上的總DNA ；
5)PCR擴增，擴增細菌16S rRNA和真核微生物18S rRNA基因；
6)高通量測序，利用高通量測序技術(shù)獲得樣品DNA目的片段序列；
7)群落分析，將所得DNA目的片段序列與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行比對，確定所得空氣微生物的系統(tǒng)分類；
8)數(shù)據(jù)庫建立，建立某地區(qū)空氣中細菌和真核微生物數(shù)據(jù)庫；
監(jiān)測方法在任何不同氣象條件下的室外大氣環(huán)境下進行。
[0006]所述步驟I)中采樣儀為青島嶗山應(yīng)用技術(shù)研宄所2031型大流量空氣采樣儀，配備三種不同粒徑的顆粒物切割器，可采集TSP、PM10、PM2.5顆粒物樣品，采樣之前將切割器用中性洗液擦洗后用70%酒精擦洗除菌，采樣濾膜為親水性普通玻璃纖維濾膜，濾膜事先滅菌，將處理后的切割器和濾膜組裝在采樣儀上，將采樣儀搬至采樣地點便可開始采樣。
[0007]所述步驟2)中采樣儀采樣口距離地面的高度為12米，采樣流量為1.0 m3/min，濾膜為長方形，有效面積為230 mmX180 mm，采樣時間設(shè)為8 h、16 h和24 ho
[0008]所述步驟3)中用無菌鑷子將無菌玻璃纖維濾膜從采樣儀采樣口上取下，無菌低溫條件下轉(zhuǎn)移至無菌操作室，用無菌剪刀將無菌玻璃纖維濾膜剪成指甲蓋大小的方塊放入250mL無菌錐形瓶中，加入150 mL無菌洗脫液，超聲洗脫5次，超聲頻率為45kHz，每次間隔為20 min，收集洗脫之后的液體，采用婦動泵無菌壓濾，婦動泵轉(zhuǎn)速設(shè)為50 rpm，全程采用一次性軟管，濾膜和壓濾裝置均需事先滅菌，用0.22 y m濾膜收集洗脫下來的微生物，棄去濾液，在無菌操作室收集濾膜用于后續(xù)DNA的提取；所述無菌洗脫液配方為:0.85%氯化鈉，0.1%吐溫-80，0.1%的蛋白胨以及5-10%蔗糖。
[0009]所述步驟4)中提取聚四氟乙烯濾膜上的總DNA方法如下:將帶有樣品的水膜置于離心管內(nèi)，加入細胞裂解緩沖液和研磨珠，渦旋混勻，之后按照DNA提取試劑盒說明書提取DNA，提取的DNA樣品于-20°C條件下保存，所述裂解液配置方法為:加入10 mL I MTris-HCl,8 mL 0.5 M EDT 和 10 mL 20%SDS 溶液，用 200 mM NaCl 稀釋至 100 mL。
[0010]所述步驟5)中擴增細菌16S rRNA和真核微生物18S rRNA基因方法如下:細菌 16S rRNA 擴增引物采用 515F/907R 引物序列(AGATCACGTGCCAGCMGCC GCGG ；AGACATGGTGCCAGCMGCCGCGG)，PCR 程序:1= 95.0 °C For 5:OOmin ；2=95.0 °C For0:30min ；3=55.0°C For 0:30min ；4=72.0°C For 1:OOmin ；5=GoTo 2 24Times ；6=72.0°CFor 5:OOmin ；7=4.0 °C Forever ;8=end，真核微生物 18S rRNA 擴增引物米用 3NDf_V4_euk_R2 引物序列(GGCAAGTCTGGTGCCAG ；ACGGTATCTATC TCTTCG), PCR 程序:1=95.0 °CFor 2:OOmin ；2=95.0°C For 0:30 min ；3=GoTo 2 24Times ；4=55.0°C For 0:30min ；5=72.0°C For 1:30 min ； 6=72.0°C For 8:OOmin ；7=4.0°C Forever ;8=end。
[0011]所述步驟7)群落分析中，通過OTUs聚類和多樣性分析等方法比較樣品之間的差升。
[0012]本發(fā)明的有益效果:1)本發(fā)明可在任何不同氣象條件下對大氣微生物群落結(jié)構(gòu)進行調(diào)查，可分析TSP、PM10與PM2.5等多種顆粒表面攜帶的微生物，在微生物檢測方面，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)分析方法相比，本發(fā)明具有覆蓋面廣，監(jiān)測時間短以及準(zhǔn)確度和靈敏度高等優(yōu)點；
2)本發(fā)明對霧霾天氣中空氣顆粒物進行分粒徑分析，可以通過比較不同顆粒物中微生物種群與其他周圍環(huán)境要素中微生物種群的相似度來判斷霧霾顆粒物中微生物的產(chǎn)生源，為微生物污染源控制提供依據(jù)；3)本發(fā)明提供的基于大規(guī)模基因測序技術(shù)的大氣顆粒物攜帶微生物群落監(jiān)測方法，可對空氣微生物的群落結(jié)構(gòu)特征進行全面分析，從而建立某一地區(qū)細菌和真核微生物數(shù)據(jù)庫，為霧霾中空氣微生物對人體健康的影響評估提供信息方面的支持，用于指導(dǎo)人們健康出行和生活。
【附圖說明】
[0013]圖1是多粒徑空氣顆粒物攜帶微生物的群落監(jiān)測方法的流程圖。
【具體實施方式】
[0014]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0015]如圖1所示，一種多粒徑空氣顆粒物攜帶微生物的群落監(jiān)測方法的步驟如下:
1)儀器準(zhǔn)備，準(zhǔn)備采樣儀及配件，所用器皿與物品要無菌處理；
2)樣品采集，利用氣泵使空氣通過采樣儀采樣口上的無菌玻璃纖維濾膜，截留攜帶有微生物的顆粒物；
3)樣品轉(zhuǎn)移，將無菌玻璃纖維濾膜上攜帶有微生物的顆粒物轉(zhuǎn)移至0.22 μ m孔徑、直徑47mm的聚四氟乙烯濾膜上；
4)DNA提取，提取聚四氟乙烯濾膜上的總DNA ；
5)PCR擴增，擴增細菌16S rRNA和真核微生物18S rRNA基因；
6)高通量測序，利用高通量測序技術(shù)獲得樣品DNA目的片段序列；
7)群落分析，將所得DNA目的片段序列與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行比對，確定所得空氣微生物的系統(tǒng)分類；
8)數(shù)據(jù)庫建立，建立某地區(qū)空氣中細菌和真核微生物數(shù)據(jù)庫；
監(jiān)測方法在任何不同氣象條件下的室外大氣環(huán)境下進行。
[0016]所述步驟I)中采樣儀為青島嶗山應(yīng)用技術(shù)研宄所2031型大流量空氣采樣儀，配備三種不同粒徑的顆粒物切割器，可采集TSP、PM10、PM2.5顆粒物樣品，采樣之前將切割器用中性洗液擦洗后用70%酒精擦洗除菌，采樣濾膜為親水性玻璃纖維濾膜，濾膜事先滅菌，將處理后的切割器和濾膜組裝在采樣儀上，將采樣儀搬至采樣地點便可開始采樣。
[0017]所述步驟2)中采樣儀采樣口距離地面的高度為12米，采樣流量為1.