0 m3/min，濾膜為長方形，有效面積為230 mmX180 mm，采樣時間設(shè)為8 h、16 h和24 ho
[0018]所述步驟3)中用無菌鑷子將無菌玻璃纖維濾膜從采樣儀采樣口上取下，無菌低溫條件下轉(zhuǎn)移至無菌操作室，用無菌剪刀將無菌玻璃纖維濾膜剪成指甲蓋大小的方塊放入250mL無菌錐形瓶中，加入150 mL無菌洗脫液，超聲洗脫5次，超聲頻率為45kHz，每次間隔為20 min，收集洗脫之后的液體，采用婦動泵無菌壓濾，婦動泵轉(zhuǎn)速設(shè)為50 rpm，全程采用一次性軟管，濾膜和壓濾裝置均需事先滅菌，用0.22 y m濾膜收集洗脫下來的微生物，棄去濾液，在無菌操作室收集濾膜用于后續(xù)DNA的提??；所述無菌洗脫液配方為:0.85%氯化鈉，0.1%吐溫-80，0.1%的蛋白胨以及5-10%蔗糖(該體系可維持微生物細胞滲透壓，同時具有一定的緩沖作用，蔗糖可作為細胞保護劑)。
[0019]所述步驟4)中提取聚四氟乙烯濾膜上的總DNA方法如下:將帶有樣品的水膜置于離心管內(nèi)，加入細胞裂解緩沖液和研磨珠，渦旋混勻，之后按照DNA提取試劑盒(PowerSoil? DNA Isolat1n Kit)說明書提取DNA，提取的DNA樣品于_20°C條件下保存，所述裂解液配置方法為:加入10 mL I M Tris-HCl、8 mL 0.5 M EDT和10 mL 20%SDS溶液，用 200 mM NaCl 稀釋至 100 mL。
[0020]所述步驟5)中擴增細菌16S rRNA和真核微生物18S rRNA基因方法如下:細菌 16S rRNA 擴增引物采用 515F/907R 引物序列(AGATCACGTGCCAGCMGCC GCGG ；AGACATGGTGCCAGCMGCCGCGG)，PCR 程序:1= 95.0 °C For 5:OOmin ；2=95.0 °C For0:30min ；3=55.0°C For 0:30min ；4=72.0°C For 1:OOmin ；5=GoTo 2 24Times ；6=72.0°CFor 5:OOmin ；7=4.0 °C Forever ;8=end，真核微生物 18S rRNA 擴增引物米用 3NDf_V4_euk_R2 引物序列(GGCAAGTCTGGTGCCAG ；ACGGTATCTATC TCTTCG), PCR 程序:1=95.0 °CFor 2:OOmin ；2=95.0°C For 0:30 min ；3=GoTo 2 24Times ；4=55.0°C For 0:30min ；5=72.0°C For 1:30 min ； 6=72.0°C For 8:OOmin ；7=4.0°C Forever ;8=end。
[0021]所述步驟7)群落分析中，通過OTUs (Operat1nal Taxonomic Units)聚類和多樣性分析等方法比較樣品之間的差異。
[0022]所述步驟8)建立某一地區(qū)細菌和真核微生物數(shù)據(jù)庫，為評價霧霾空氣微生物對人體健康的影響以及解析霧霾源的產(chǎn)生方面提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
[0023]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施方案，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種多粒徑空氣顆粒物攜帶微生物的群落監(jiān)測方法，其特征在于，它的步驟如下: 1)儀器準備，準備采樣儀及配件，所用器皿與物品要無菌處理； 2)樣品采集，利用氣泵使空氣通過采樣儀采樣口上的無菌玻璃纖維濾膜，截留攜帶有微生物的顆粒物； 3)樣品轉(zhuǎn)移，將無菌玻璃纖維濾膜上攜帶有微生物的顆粒物轉(zhuǎn)移至0.22 μ m孔徑、直徑47mm的聚四氟乙烯濾膜上； 4)DNA提取，提取聚四氟乙烯濾膜上的總DNA ； 5)PCR擴增，擴增細菌16S rRNA和真核微生物18S rRNA基因； 6)高通量測序，利用高通量測序技術(shù)獲得樣品DNA目的片段序列； 7)群落分析，將所得DNA目的片段序列與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行比對，確定所得空氣微生物的系統(tǒng)分類； 8)數(shù)據(jù)庫建立，建立某地區(qū)空氣中細菌和真核微生物數(shù)據(jù)庫； 監(jiān)測方法在任何不同氣象條件下的室外大氣環(huán)境下進行。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟I)中采樣儀為青島嶗山應(yīng)用技術(shù)研宄所2031型大流量空氣采樣儀，配備三種不同粒徑的顆粒物切割器，可采集TSP、PM10、PM2.5顆粒物樣品，采樣之前將切割器用中性洗液擦洗后用70%酒精擦洗除菌，采樣濾膜為親水性普通玻璃纖維濾膜，濾膜事先滅菌，將處理后的切割器和濾膜組裝在采樣儀上，將采樣儀搬至采樣地點便可開始采樣。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中采樣儀采樣口距離地面的高度為12米，采樣流量為1.0 m3/min，濾膜為長方形，有效面積為230mmX 180 mm，采樣時間設(shè)為 8 h、16 h 和 24 h。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中用無菌鑷子將無菌玻璃纖維濾膜從采樣儀采樣口上取下，無菌低溫條件下轉(zhuǎn)移至無菌操作室，用無菌剪刀將無菌玻璃纖維濾膜剪成指甲蓋大小的方塊放入250mL無菌錐形瓶中，加入150 mL無菌洗脫液，超聲洗脫5次，超聲頻率為45kHz，每次間隔為20 min，收集洗脫之后的液體，采用蠕動泵無菌壓濾，蠕動泵轉(zhuǎn)速設(shè)為50 rpm，全程采用一次性軟管，濾膜和壓濾裝置均需事先滅菌，用0.22μ m濾膜收集洗脫下來的微生物，棄去濾液，在無菌操作室收集濾膜用于后續(xù)DNA的提??；所述無菌洗脫液配方為:0.85%氯化鈉，0.1%吐溫-80，0.1%的蛋白胨以及5-10%蔗糖。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟4)中提取聚四氟乙烯濾膜上的總DNA方法如下:將帶有樣品的水膜置于離心管內(nèi)，加入細胞裂解緩沖液和研磨珠，渦旋混勻，之后按照DNA提取試劑盒說明書提取DNA，提取的DNA樣品于_20°C條件下保存，所述裂解液配置方法為:加入 10 mL I M Tris-HCl,8 mL 0.5 M EDT和 10 mL 20%SDS溶液，用 200mM NaCl 稀釋至 100 mL。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟5)中擴增細菌16SrRNA和真核微生物18S rRNA基因方法如下:細菌16S rRNA擴增引物采用515F/907R引物序列(AGATCACGTGCCAGCMGCC GCGG ；AGACATGGTGCCAGCMGCCGCGG), PCR 程序:1= 95.0 °C For5:OOmin ；2=95.0°C For 0:30min ；3=55.0°C For 0:30min ；4=72.0°C For 1:OOmin ；5=GoTo2 24Times ；6=72.0°C For 5: OOmin ；7=4.0°C Forever ;8=end，真核微生物 18S rRNA 擴增引物采用 3NDf-V4_ euk_R2 引物序列(GGCAAGTCTGGTGCCAG ；ACGGTATCTATC TCTTCG)，PCR程序:1=95.(TC For 2:OOmin ；2=95.0°C For 0:30 min ；3=GoTo 2 24Times ；4=55.0°CFor 0:30min ；5=72.0 °C For 1:30 min ； 6=72.0 °C For 8: OOmin ；7=4.0 °C Forever ；8=endo
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟7)群落分析中，通過OTUs聚類和多樣性分析等方法比較樣品之間的差異。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多粒徑空氣顆粒物攜帶微生物的群落監(jiān)測方法。它包括以下步驟：1）儀器準備、2）樣品采集、3）樣品轉(zhuǎn)移、4）DNA提取、5）PCR擴增、6）高通量測序、7）群落分析、8）數(shù)據(jù)庫建立。本發(fā)明可在任何不同氣象條件下對大氣顆粒物攜帶微生物的群落結(jié)構(gòu)進行調(diào)查，可分析TSP、PM10與PM2.5等多種顆粒表面攜帶的微生物，在大氣微生物群落檢測方面，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)分析方法相比，本發(fā)明具有覆蓋面廣，檢測準確度和靈敏度高等優(yōu)點，對評價霧霾中空氣微生物對人體健康的影響以及判斷霧霾的產(chǎn)生源等方面有著重要的價值。
【IPC分類】G01N15-00, G06F17-30
【公開號】CN104568680
【申請?zhí)枴緾N201510017894
【發(fā)明人】胡寶蘭, 張旭, 王家騏, 何嶄飛, 葉天強, 徐新華, 胡勤海, 鄭平
【申請人】浙江大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月14日