將穩(wěn)定轉染的細胞鋪于六孔板中，待其長滿后先用PBS洗漆2次；將含有ImMPMSF 的RIPA裂解液150 y 1滴加入六孔板的一個孔，晃動六孔板，使蛋白裂解液均勻覆蓋細胞， 冰上裂解30min，期間每隔5min晃動六孔板一次，使蛋白裂解液均勻覆蓋細胞，收集裂解液 于巧pendorf管中，加等體積的2 X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混勻，沸水中煮5min，得到制 備好的蛋白樣品用15%的SDS-PAGE進行電泳分離，然后轉印到PVDF膜上，用5%的脫脂奶 粉封閉后，一抗為油cam公司pp65單克抗體1 ;1000稀釋，4°C解育過夜，TPST洗漆S次，每 次5min，二抗為中杉金橋HRP標記的羊抗鼠IgGl: 5000稀釋，室溫解育比，最后TPST洗漆 S次，每次5min，E化法進行曝光；
[0044] D、陽性玻片的制備
[0045] 準備兩瓶細胞，一瓶為穩(wěn)定轉染pp65的，一瓶為正常肥K293細胞；將穩(wěn)定轉染的 細胞消化后，并用PBS重懸，細胞計數后調節(jié)細胞濃度為5000個/ml ;將正常肥K293細胞 消化后并用PBS重懸，細胞計數后調節(jié)細胞濃度為5 X 1〇7個/ml ;取1ml穩(wěn)定轉染的細胞 與4ml正常細胞混合均勻，在玻片上涂有疏水性材料形成的直徑約1cm的小孔中均勻涂布 50 y 1混合細胞，將玻片置于風機下，水分蒸發(fā)待干時每孔補加100 y 1 4%的多聚甲醒，固 定15min，干燥后保存于-80°C，該玻片即為HCMV pp65抗原血癥陽性玻片。
[0046] 所述的一種人巨細胞病毒pp65抗原血癥免疫巧光法檢測試劑盒陽性對照玻片的 制備方法，其特征在于；一種權利要求2所述改造后的HCMV pp65氨基酸序列如SEQ No. 1 所示。
[0047] 所述的一種人巨細胞病毒pp65抗原血癥免疫巧光法檢測試劑盒陽性對照玻片的 制備方法，其特征在于；所述改造后的HCMV pp65核巧酸編碼序列如SEQ No. 2所示。
[0048] 所述的一種人巨細胞病毒pp65抗原血癥免疫巧光法檢測試劑盒陽性對照玻片的 制備方法，其特征在于；HCMVPP65抗原血癥檢免疫巧光法測試劑盒陽性對照玻片所用pp65 陽性細胞為轉染了所述表達改造后的HCMV pp65真核表達載體。
[0049] 所述的一種人巨細胞病毒pp65抗原血癥免疫巧光法檢測試劑盒陽性對照玻片的 制備方法，其特征在于；所述的HCMV TR株pp65基因序列的Genebank登陸號為；KJ743149。 [0化0] 有益效果；本發(fā)明陽性細胞分散均勻，染色鮮艷，明亮，對比對高；
[0化1] HCMV pp65抗原血癥免疫巧光法檢測試劑盒的兩大技術核屯、為制備pp65單克隆 抗體和陽性對照品（玻片）。我們對pp65編碼基因進行改造，通過S輪PCR在其3'端加 =個核定位信號，而且在核定位信號之前加上一個脯氨酸（Pro)用來終止其可能存在的a 螺旋結構。將改造后的pp65編碼基因導入真核細胞時發(fā)現，其已完全定位于細胞核。用該 種改造后的細胞株制作的陽性品（玻片）辨識度更高，符合病毒感染時的實際情況。另外， HCMV標準株AD169在實驗室長期傳代過程中，其基因組會發(fā)生變異。通過對AD169株pp65 編碼基因與野毒株pp65編碼基因的比對后我們發(fā)現，存在多處的堿基突變（替換），該些突 變分布在整個編碼序列。如果該突變發(fā)生在與抗體結合表位，將會導致制備的相應特異性 抗體不能夠與其相互反應。因此，我們采用臨床分離株（TR株）作為改造模版，避免了基因 突變導致的抗原與抗體不能夠結合的結果，保證了用于檢測時的可靠性和分辨率。
【附圖說明】
[0化2] 圖1為用PCR方法對HCMV TR株pp65編碼基因進行改造結果，其中泳道1為第一 輪PCR結果，泳道2為第二輪PCR結果，泳道3為第S輪PCR結果；
[0化3] 圖2為改造后的pp65編碼基因連接至真核表達載體pcDNA3. lA酶切結果，其中泳 道1為酶切之前的結果，泳道2為化0 I單酶切結果，泳道3為化n I單酶切結果，泳道4 為化0 I和化n I雙酶切結果；
[0化4] 圖3為改造后的HCMV pp65編碼基因連接至真核表達載體PCDNA3. 1A重組質粒測 序結果；
[0化5] 圖4為轉染改造后pp65編碼基因的肥K293細胞免疫巧光鑒定結果，其中A為轉 染了改造后pp65編碼基因的肥K293細胞，可見其表達目的蛋白，而且可W被商品化的PP65 單抗識別，B為正常肥K293細胞，不表達目的蛋白；
[0化6] 圖5為轉染改造后卵65編碼基因的肥K293細胞Western blot鑒定結果。其中 泳道1為轉染了改造后pp65編碼基因的肥K293細胞，可見其表達目的蛋白，而且可W被商 品化的pp65單抗識別，條帶大小與預測相符合。泳道2為正常肥K293細胞，不表達目的蛋 白；
[0化7] 圖6為本發(fā)明制備pp65抗原血癥陽性玻片的實際工作效果和國外某公司pp65抗 原血癥陽性對照玻片的對比。其中A為本發(fā)明制備的陽性對照玻片，B為國外某公司pp65 抗原血癥陽性對照玻片。
【具體實施方式】
[0化引 1. HCMV pp65編碼基因的改造
[0059] (1)本發(fā)明人根據Genebank中已公布的HCMV TR株pp65編碼基因序列（登陸號； KJ743149該序列為發(fā)明人所登陸），設計S輪PCR引物，通過S輪PCR循環(huán)在pp65編碼基 因的3'端加上S段核定位信號和一個脯氨酸。S輪PCR循環(huán)引物如下：
[0060] 卵65化S-F ;CTCGAGATGGAGTCGCGCGGT
[0061] pp65化S-R1 ;TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCACCTCGGTGCTTTTTG
[0062] pp65化S-R2 ;TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTGGATCTACCTTTC
[0063] pp65化S-R3 ;GGTACCTCTAGATCCGGTGGATCCTACCTTTCTCTTTGGATCTACCTTTCTC
[0064] 先W肥MV TR株DM為模版，Wpp65化S-F和pp65化S-Rl為引物進行第一輪PCR。 再W第一輪PCR產物為模板W PP65化S-F和pp65化S-R2為引物進行第二輪PCR。最后W第 二輪PCR產物為模板W PP65化S-F和pp65化S-R3為引物進行第S輪PCR。
[00化](2)將第S輪PCR產物通過化n I和化0 I限制性酶切位點連接至真核表達載體 PCDNA3. 1A。構建的重組載體命名為PCDNA3. 1A-PP65化S。
[0066] 2. pp65穩(wěn)轉細胞株的構建
[0067] (1)轉染
[0068] 轉染前一天肥K293細胞1 X lOVml鋪于六孔板中，每孔2ml。轉染時在巧pendorf 管中加入150 y 1 DMEM培養(yǎng)液，加入重組質粒2 y g混勻，再加入Promega公司轉染試劑 化GE肥皿Transfection Reagent 4 y 1混勻。室溫放置15min后加入六孔板的一個孔中， 輕輕晃動六孔板，是復合物均勻分散開來。
[0069] 然后至于37°C，5% C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4她。
[0070] (2)篩選
[0071] 轉染后4她棄去六孔板中培養(yǎng)液，PBS洗漆2次，換成含G-418 400ng/ml的DMEM 完全培養(yǎng)基。每隔3天棄去舊培養(yǎng)基和死細胞，換新的含有G-418400ng/ml的DMEM完全培 養(yǎng)基。藥物篩選2-3周直到明顯的細胞集落形成。
[00巧 做擴大培養(yǎng)
[0073] 將六孔板中的細胞集落消化下來，轉移到25cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)使用含有 G-418 400ng/ml的DMEM完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。待細胞張滿后傳代至更大面積的細胞培養(yǎng) 瓶，同時降低G4-18濃度至20化g/ml。
[0074] (4)細胞凍存
[0075] 擴大培養(yǎng)后凍存一定數量的種子細胞。
[0076] 3.穩(wěn)定轉染細胞株的鑒定
[0077] (1)免疫巧光法鑒定
[007引將穩(wěn)定轉染的細胞鋪于六孔板中，待其長滿后先用PBS洗漆2次，4%多聚甲醒 固定15min，1 %曲拉通37°C穿透15min，20%小牛血清封閉30min。一抗為油cam公司 (油49214)9965單克隆抗體1;20稀釋，371：解育化。？85洗漆^次，每次5111111。二抗為^'6 公司Alexa Fluor 488conjugated羊抗鼠IgG 1:1000倍稀釋，室溫解育30min。同時采用 DAPI和伊文思藍襯染。結果如說明書附圖4,可W看見細胞表達PP65蛋白，在巧光顯微鏡 下為蘋果綠色巧光信號。且pp65亞細胞定位于細胞核。
[0079] (2) Western blot 鑒定
[0080] 將穩(wěn)定轉染的細胞鋪于六孔板中，待其長滿后先用PBS洗漆2次。將含有ImMPMSF 的RIPA裂解液150 y 1滴加入六孔板的一個孔，晃動六孔板，使蛋白裂解液均勻覆蓋細胞， 冰上裂解30min，期間每隔5min晃動六孔板一次，使蛋白裂解液均勻覆蓋細胞。收集裂解 液于巧pendo計管中，加等體積的2 X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混勻，沸水中煮5min。制 備好的蛋白樣品用15%的SDS-PAGE進行電泳分離，然后轉印到PVDF膜上。5%的脫脂 奶粉封閉后，一抗為油cam公司（油49214)pp65單克隆抗體1 ;1000稀釋，4°C解育過夜。 TPST洗漆S次，每次5min。二抗為中山金橋HRP標記的羊抗鼠IgGl: 5000稀釋，室溫解育 比。最后TPST洗漆S次，每次5min，E化法進行曝光。結果如說明書附圖5,可見穩(wěn)定轉染 PCDNA3. 1A-PP65化S質粒的細胞株表達pp65蛋白，其分子量大小約為72邸，而正常肥K293 細胞不表達pp65蛋白。
[0081] 4.陽性玻片的制備
[0082] 準備兩瓶細胞，一瓶為穩(wěn)定轉染pp65的，一瓶為正常肥K293細胞。將穩(wěn)定轉染的 細胞消化后，并用PBS重懸，細胞計數后調節(jié)細胞濃度為5000個/ml。將正常肥K293細胞 消化后并用PBS重懸，細胞計數后調節(jié)細胞濃度為5 X 1〇7個/ml。取1ml穩(wěn)定轉染的細胞 與4ml正常細胞混合均勻，在玻片上涂有疏水性材料形成的直徑約1cm的小孔中均勻涂布 50 y 1混合細胞，將玻片置于風機下，水分