蒸發(fā)待干時(shí)每孔補(bǔ)加100 y 1 4%的多聚甲醒，固 定15min。干燥后保存于-80°C。該玻片即為HCMVpp65抗原血癥陽性玻片。
[0083] 圖1為用PCR方法對(duì)HCMV TR株pp65編碼基因進(jìn)行改造結(jié)果，其中泳道1為第一 輪PCR結(jié)果，泳道2為第二輪PCR結(jié)果，泳道3為第S輪PCR結(jié)果；
[0084] 圖2為改造后的pp65編碼基因連接至真核表達(dá)載體PCDNA3. 1A酶切結(jié)果，其中泳 道1為酶切之前的結(jié)果，泳道2為化0 I單酶切結(jié)果，泳道3為化n I單酶切結(jié)果，泳道4 為化0 I和化n I雙酶切結(jié)果；
[0085] 圖3為改造后的HCMV pp65編碼基因連接至真核表達(dá)載體pcDNA3. lA重組質(zhì)粒測(cè) 序結(jié)果；
[0086] 圖4為轉(zhuǎn)染改造后pp65編碼基因的肥K293細(xì)胞免疫巧光鑒定結(jié)果，其中A為轉(zhuǎn) 染了改造后pp65編碼基因的肥K293細(xì)胞，可見其表達(dá)目的蛋白，而且可W被商品化的pp65 單抗識(shí)別，B為正常肥K293細(xì)胞，不表達(dá)目的蛋白；
[0087] 圖5為轉(zhuǎn)染改造后pp65編碼基因的肥K293細(xì)胞Western blot鑒定結(jié)果。其中 泳道1為轉(zhuǎn)染了改造后pp65編碼基因的肥K293細(xì)胞，可見其表達(dá)目的蛋白，而且可W被商 品化的pp65單抗識(shí)別，條帶大小與預(yù)測(cè)相符合。泳道2為正常肥K293細(xì)胞，不表達(dá)目的蛋 白；
[008引圖6為本發(fā)明制備pp65抗原血癥陽性玻片的實(shí)際工作效果和國(guó)外某公司pp65抗 原血癥陽性對(duì)照玻片的對(duì)比。其中A為本發(fā)明制備的陽性對(duì)照玻片，B為國(guó)外某公司pp65 抗原血癥陽性對(duì)照玻片。
[0089] 本實(shí)施例所制備的HCMV pp65抗原血癥陽性玻片與荷蘭IQ公司pp65抗原血癥檢 測(cè)試劑盒中陽性對(duì)照玻片各十張，針對(duì)每張玻片細(xì)胞總數(shù)、陽性細(xì)胞數(shù)、涂片面積等項(xiàng)目比 較結(jié)果如下：
[0090]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種人巨細(xì)胞病毒PP65抗原血癥免疫熒光法檢測(cè)試劑盒陽性對(duì)照玻片的制備方 法，其特征在于：將HCMV TR株的pp65編碼基因改造、構(gòu)建至真核表達(dá)載體pcDNA3. 1，再轉(zhuǎn) 染至HEK293細(xì)胞，并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株用于制作pp65抗原血癥檢測(cè)試劑盒陽性對(duì)照玻 片。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人巨細(xì)胞病毒pp65抗原血癥免疫熒光法檢測(cè)試劑盒陽 性對(duì)照玻片的制備方法，其特征在于：對(duì)HCMV TR株的pp65編碼基因改造通過如下方法實(shí) 現(xiàn)： (1) 先以HCMV TR株pp65基因序列為模版，以pp65NLS-F和pp65NLS-Rl為引物進(jìn)行第 一輪 PCR ; (2) 再以第一輪PCR產(chǎn)物為模板以pp65NLS-F和pp65NLS-R2為引物進(jìn)行第二輪PCR ; (3) 后以第二輪PCR產(chǎn)物為模板以pp65NLS-F和pp65NLS-R3為引物進(jìn)行第三輪PCR ; (4) 將第三輪PCR產(chǎn)物通過命/? /和通〇 /限制性酶切位點(diǎn)連接至真核表達(dá)載體 pcDNA3. IA ； 三輪PCR循環(huán)引物如下： pp65NLS-F ：CTCGAGATGGAGTCGCGCGGT pp65NLS-Rl ：TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCACCTCGGTGCTTTTTG pp65NLS-R2 ：TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTGGATCTACCTTTC pp65NLS-R3 ：GGTACC TCTAGATCCGGTGGATCCTACCTTTCTCTTTGGATCTACCTTTCTC。
3. 根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種人巨細(xì)胞病毒pp65抗原血癥免疫熒光法檢測(cè)試劑盒陽 性對(duì)照玻片的制備方法，其特征在于：包括以下步驟： A、 HCMV pp65編碼基因的改造 (1) 根據(jù)Genebank中已公布的HCMV TR株pp65編碼基因序列，設(shè)計(jì)三輪PCR引物，通 過三輪PCR循環(huán)在pp65編碼基因的3'端加上三段核定位信號(hào)和一個(gè)脯氨酸； 三輪PCR循環(huán)引物如下： pp65NLS-F ：CTCGAGATGGAGTCGCGCGGT pp65NLS-Rl ：TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCACCTCGGTGCTTTTTG pp65NLS-R2 ：TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTGGATCTACCTTTC pp65NLS-R3 ：GGTACC TCTAGATCCGGTGGATCCTACCTTTCTCTTTGGATCTACCTTTCTC 三輪PCR循環(huán)指的是：先以HCMV TR株DNA為模版，以pp65NLS-F和pp65NLS-Rl為引 物進(jìn)行第一輪PCR; 再以第一輪PCR產(chǎn)物為模板以pp65NLS-F和pp65NLS-R2為引物進(jìn)行第二輪PCR; 最后以第二輪PCR產(chǎn)物為模板以pp65NLS-F和pp65NLS-R3為引物進(jìn)行第三輪PCR ; (2) 將第三輪PCR產(chǎn)物通過命/? /和通〇 /限制性酶切位點(diǎn)連接至真核表達(dá)載體 pcDNA3. 1A，構(gòu)建的重組載體命名為pcDNA3. lA-pp65NLS ; B、 pp65穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建 (1)轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前一天將HEK293細(xì)胞I X IO5個(gè)/ml鋪于六孔板中，每孔2ml ;轉(zhuǎn)染時(shí)在印pendorf 管中加入150 μ I DMEM培養(yǎng)液，加入重組質(zhì)粒2 μ g混勻，再加入Promega公司轉(zhuǎn)染試劑 FuGENE HD Transfection Reagent 4 μ 1混勾，室溫放置15min后加入六孔板的一個(gè)孔中， 輕輕晃動(dòng)六孔板，使復(fù)合物均勻分散開來，然后至于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h ; (2) 篩選 步驟（1)的培養(yǎng)結(jié)束后，棄去六孔板中培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，換成含G-418 400ng/ ml的DMEM完全培養(yǎng)基，每隔3天棄去舊培養(yǎng)基和死細(xì)胞，換新的含有G-418 400ng/ml的 DMEM完全培養(yǎng)基，持續(xù)進(jìn)行上述藥物篩選培養(yǎng)2-3周直到明顯的細(xì)胞集落形成； (3) 擴(kuò)大培養(yǎng) 將六孔板中的細(xì)胞集落消化下來，轉(zhuǎn)移到25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)使用含有G-418 400ng/ml的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代至更大面積的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，同時(shí) 降低G4-18濃度至200ng/ml ; (4) 細(xì)胞凍存 擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存一定數(shù)量的種子細(xì)胞，即獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞備用； C、 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的鑒定 (1) 免疫熒光法鑒定 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞鋪于六孔板中，待其長(zhǎng)滿后先用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定 15min，1%曲拉通37°C穿透15min，20%小牛血清封閉30min ;-抗為abeam公司pp65單克 隆抗體1 :20稀釋，37°C孵育2h，PBS洗滌三次，每次5min ;二抗為L(zhǎng)ife公司Alexa Fluor 488 conjugated羊抗鼠 IgG 1:1000倍稀釋，室溫孵育30min，同時(shí)采用DAPI襯染； (2) Western blot 鑒定 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞鋪于六孔板中，待其長(zhǎng)滿后先用PBS洗滌2次；將含有ImM PMSF的 RIPA裂解液150 μ 1滴加入六孔板的一個(gè)孔，晃動(dòng)六孔板，使蛋白裂解液均勻覆蓋細(xì)胞，冰 上裂解30min，期間每隔5min晃動(dòng)六孔板一次，使蛋白裂解液均勻覆蓋細(xì)胞，收集裂解液于 eppendorf管中，加等體積的2 X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混勾，沸水中煮5min，得到制備 好的蛋白樣品用15%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉 封閉后，一抗為abeam公司pp65單克抗體I :1000稀釋，4°C孵育過夜，TPST洗滌三次，每次 5min，二抗為中杉金橋HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgGl :5000稀釋，室溫孵育lh，最后TPST洗滌三 次，每次5min，ECL法進(jìn)行曝光； D、 陽性玻片的制備 準(zhǔn)備兩瓶細(xì)胞，一瓶為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PP65的，一瓶為正常HEK293細(xì)胞；將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 消化后，并用PBS重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5000個(gè)/ml ;將正常HEK293細(xì)胞消化后 并用PBS重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5 X IO7個(gè)/ml ;取Iml穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與4ml正 常細(xì)胞混合均勻，在玻片上涂有疏水性材料形成的直徑約Icm的小孔中均勻涂布50 μ 1混 合細(xì)胞，將玻片置于風(fēng)機(jī)下，水分蒸發(fā)待干時(shí)每孔補(bǔ)加100 μ 1 4%的多聚甲醛，固定15min， 干燥后保存于-80 °C，該玻片即為HCMV pp65抗原血癥陽性玻片。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人巨細(xì)胞病毒pp65抗原血癥免疫熒光法檢測(cè)試劑盒陽 性對(duì)照玻片的制備方法，其特征在于：一種權(quán)利要求2所述改造后的HCMV pp65氨基酸序列 如SEQ No. 1所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人巨細(xì)胞病毒pp65抗原血癥免疫熒光法檢測(cè)試劑盒 陽性對(duì)照玻片的制備方法，其特征在于：所述改造后的HCMV pp65核苷酸編碼序列如SEQ No. 2所示。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人巨細(xì)胞病毒pp65抗原血癥免疫熒光法檢測(cè)試劑盒陽 性對(duì)照玻片的制備方法，其特征在于：HCMVpp65抗原血癥檢免疫熒光法測(cè)試劑盒陽性對(duì)照 玻片所用PP65陽性細(xì)胞為轉(zhuǎn)染了所述表達(dá)改造后的HCMV pp65真核表達(dá)載體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人巨細(xì)胞病毒pp65抗原血癥免疫熒光法檢測(cè)試劑盒陽 性對(duì)照玻片的制備方法，其特征在于：所述的HCMV TR株pp65基因序列的Genebank登陸號(hào) 為：KJ743149。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人巨細(xì)胞病毒pp65抗原血癥免疫熒光法檢測(cè)試劑盒陽性對(duì)照玻片的制備方法。涉及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCMV？pp65編碼基因的細(xì)胞株構(gòu)建，以及用于HCMV？pp65抗原血癥免疫熒光法檢測(cè)試劑盒。所述方法包括采用基因工程方法對(duì)HCMV？TR株pp65編碼基因進(jìn)行改造，在其3’端加上三個(gè)核定位信號(hào)、將改造后的pp65編碼基因連接至真核表達(dá)載體pcDNA3.1A、將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入HEK293（人胚腎）細(xì)胞并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞、將該穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞與為轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞按一定比例混合用于制備陽性對(duì)照玻片。
【IPC分類】G01N33-569, C12N15-38, C12N5-10, C12N15-85
【公開號(hào)】CN104569388
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510016199
【發(fā)明人】王明麗, 張文昌, 劉峰
【申請(qǐng)人】王明麗, 安徽博睿生物科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年1月13日