一種草魚出血病病毒抗體elisa檢測試劑盒及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及獸用生物制品技術領域，具體設及一種草魚出血病病毒抗體化ISA檢 測試劑盒及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 草魚是我國淡水養(yǎng)魚的主要品種，其產(chǎn)量約占淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的20%。草魚出血 病是魚種培育階段一種流行地區(qū)廣泛、流行季節(jié)長、發(fā)病率高、死亡率高、危害性大，是危害 草魚最為嚴重的病毒性疾病，造成重大的經(jīng)濟損失。目前，沒有治療草魚出血病的特效藥 物，主要通過疫苗、養(yǎng)殖環(huán)境等方面控制草魚出血病疫情的發(fā)生。在評價疫苗效果方面，草 魚出血病疫苗免疫魚產(chǎn)生的抗體效價是重要的指標。目前，市場上沒有關于檢測草魚出血 病病毒抗體的化ISA試劑盒。
[0003] 本發(fā)明主要根據(jù)草魚出血病病毒繁殖和其產(chǎn)生抗體的特征，?？谥苽淞讼鄳獧z測 抗體的化ISA試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種草魚出血病病毒抗體 ELISA檢測試劑盒，該試劑盒中ELISA板包被的草魚出血病病毒純度高，檢測更靈敏；經(jīng)過 酶解膠原蛋白封閉、戊二醒固定、干燥后有效延長保存期。
[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術方案如下：
[0006] 一種草魚出血病病毒抗體化ISA檢測試劑盒，其包括鼠抗兔IgG的酶標記物、包被 有草魚出血病病毒的化ISA板。
[0007] 上述的化ISA檢測試劑盒還包括標準血清、洗漆液、TMB底物顯色液、終止液。
[000引本發(fā)明還提供了上述草魚出血病病毒抗體的化ISA檢測試劑盒的制備方法，其包 括W下幾個步驟：
[0009] 1化LISA板包被抗原的制備；采用CIK細胞接種草魚出血病病毒獲得病毒懸浮液； 對病毒懸浮液進行離屯、、超濾濃縮后得到濃縮液，將濃縮液依次經(jīng)過分子篩層析、陰離子交 換層析、超濾濃縮后獲得精純病毒液；
[0010] 2)包被液的制備：包被液為0. 05mol/L磯酸鹽緩沖液，該包被液的抑為9?9. 8 ;
[0011] 3)洗漆液的制備：洗漆液為0. 15mol/L含吐溫-20的磯酸鹽緩沖液，該洗漆液的 抑為7. 4,吐溫-20的體積濃度為0. 05% ;
[0012] 4)封閉液的制備；在上述洗漆液中加入50?500 y g/ml的酶解膠原蛋白，即得封 閉液；
[0013] 5化LISA板的制備；將步驟1)制得的精純病毒液加入到包被液中進行稀釋至濃度 為0.5?10 yg/ml的病毒蛋白稀釋液，將病毒蛋白稀釋液加入到化ISA板的每孔中，2? 8°C解育過夜；然后使用洗漆液洗漆，接著向化ISA板每孔中加入100 y 1封閉液后置于2? 8°C冰箱中解育過夜；再使用洗漆液洗漆后，加入0. 3ml含有濃度為0. 5?2%的戊二醒的 洗漆液在2?8°C下解育過夜；使用洗漆液洗漆后在37°C下干燥12?2化，干燥后使用膜 封閉化ISA板，37°C保存。
[0014] 具體地，在上述的步驟1)中采用CIK細胞接種草魚出血病病毒具體包括W下步 驟：
[0015] a、在無菌條件下采用孔徑為10?100K的超濾膜對胎牛血清進行超濾，收集濾出 液，得到營養(yǎng)液；較佳的超濾膜孔徑為30K ;
[0016] b、采用M199培養(yǎng)基培養(yǎng)CIK細胞，長滿單層后加入膜蛋白酶進行消化，然后使用 移液管反復輕輕吹打成單細胞懸浮液，在25°C下按照體積比1:3接種傳代培養(yǎng)；
[0017] C、待CIK細胞生長至單層致密后接種0.03M0I的草魚出血病病毒，加入步驟a所 制得的營養(yǎng)液后25°C下培養(yǎng)4?6天后獲得病毒懸浮液。
[0018] 具體地，在上述的步驟1)中所述的離屯、是將病毒懸浮液在4000?6000r/min的 轉(zhuǎn)速下進行離屯、，離屯、時間為20?60min，然后收集上清液。其中，較佳的方案中，離屯、轉(zhuǎn)速 為4500?6000r/min，離屯、時間為30?60min。
[0019] 將上述離屯、步驟后得到的上清液采用孔徑為10?300K的超濾膜進行超濾，收集 非濾出液，得到濃縮液。較佳的方案中超濾膜的孔徑為10?100K。
[0020] 具體地，在上述的步驟1)中的分子篩層析采用填料為Superdex? 200、填料高度 為20?80cm的層析柱；上樣前用PH為7. 2的0. Olmol/L磯酸鹽緩沖液平衡層析柱，然后 將體積為填料體積的5?20%的濃縮液上樣至層析柱中，使用PH為7. 2的0. Olmol/L磯酸 鹽緩沖液進行洗脫，收集第一洗脫峰樣品，得到初純液。
[002U 具體地，在上述的步驟1)中的陰離子交換層析采用填料為Cellufine Sul化te的 層析柱；上樣前用PH為7. 2的0. Olmol/L磯酸鹽緩沖液平衡層析柱，然后將初純液上樣至 層析柱中，使用0. 5mol/L化C1溶液進行梯度洗脫，收集第二洗脫峰樣品，得到精純液。
[0022] 將經(jīng)陰離子交換層析得到的精純液采用孔徑為10?300K的超濾膜進行超濾，收 集非濾出液，得到精純病毒液。較佳的方案中，超濾膜的孔徑為10?100K。
[0023] 在上述步驟4)中，封閉液的制備具體包括W下步驟：
[0024] A、在5?lOg明膠中加入200ml用超純水配制的PBS溶液，完全溶解后進行濕熱 高壓滅菌，溫度為121°C、滅菌時間為20min ;
[0025] B、滅菌結束后自然冷卻至常溫，加入0.25%膜酶溶液，37°C下消化8-2化；重復該 步驟1-3次后得到膜酶消化液；
[0026] C、使用孔徑為100K的超濾膜對膜酶消化液進行超濾，收集濾出液；然后使用孔徑 為30K的超濾膜對上述濾出液進行超濾，收集非超濾液，得到酶解膠原蛋白；
[0027] D、將上述酶解膠原蛋白W 50?500 y g/ml的量加入到步驟3)所述洗漆液中，即 得封閉液。
[002引相比現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果在于：
[0029] 1、本發(fā)明通過采用胎牛血清中30KDa W下的小分子營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)、收獲草魚出血 病病毒，然后經(jīng)過超濾、分子篩層析、陰離子交換層析等步驟純化，獲得純度非常高的病毒， 其病毒滴度（TCIDw)大于1〇7 5/0. 1ml時，蛋白含量小于100 y g/ml，使得本發(fā)明所述的試劑 盒檢測草魚出血病病毒抗體更加靈敏精準；其中，超濾膜超濾是為了去除小于超濾膜孔徑 的蛋白質(zhì)，同時具有濃縮的作用；而分子篩層析去除的是與草魚出血病病毒在層析過程中 能夠很好分離開的蛋白質(zhì)；而陰離子交換層析去除的是與草魚呼腸孤病毒帶負電荷差異較 大的蛋白質(zhì)。
[0030] 2、本發(fā)明通過對包被有高純度的草魚出血病病毒的化ISA板采用分子量為30? lOOKDa酶解膠原蛋白進行封閉、并采用0. 5-2%的戊二醒進行固定、干燥，能夠有效延長試 劑盒的保存期，可在37°C下保存2個月。
[0031] 3、本發(fā)明所述的試劑盒的制備方法操作簡單易行。
[0032] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明。
【附圖說明】
[0033] 圖1為本發(fā)明所述的濃縮液經(jīng)過分子篩層析的分離效果圖；
[0034] 圖2為本發(fā)明所述的初純液經(jīng)過陰離子交換層析的分離效果圖。
【具體實施方式】
[0035] 一種草魚出血病病毒抗體化ISA檢測試劑盒，其包括鼠抗兔IgG的酶標記物、包被 有草魚出血病病毒的化ISA板。
[0036] 上述的草魚出血病病毒抗體化ISA檢測試劑盒還包括標準血清、洗漆液、TMB底物 顯色液、終止液。
[0037] 上述草魚出血病病毒抗體的化ISA檢測試劑盒的制備方法，其包括W下幾個步 驟：
[003引 1化LISA板包被抗原的制備；采用CIK細胞接種草魚出血病病毒獲得病毒懸浮液； 對病毒懸浮液進行離屯、、超濾濃縮后得到濃縮液，將濃縮液依次經(jīng)過分子篩層析、陰離子交 換層析、超濾濃縮后獲得精純病毒液；
[0039] 2)包被液的制備：包被液為0. 05mol/L磯酸鹽緩沖液，該包被液的抑為9?9. 8 ;
[0040] 如洗漆液的制備；洗漆液為0. 15mol/L含吐溫-20的磯酸鹽緩沖液，該洗漆液的 抑為7. 4,吐溫-20的體積濃度為0. 05% ;
[004U 4)封閉液的制備；在上述洗漆液中加入50?500 y g/ml的酶解膠原蛋白，即得封 閉液；
[0042] 5化LISA板的制備；將步驟1)制得的精純病毒液加入到包被液中進行稀釋至濃度 為0.5?10 yg/ml的病毒蛋白稀釋液，將病毒蛋白稀釋液加入到化ISA板的每孔中，2? 8°C解育過夜；然后使用洗漆液洗漆，接著向化ISA板每孔中加入100 y 1封閉液后置于2? 8°C冰箱中解育過夜；再使用洗漆液洗漆后，加入0. 3ml含有濃度為0. 5?2%的戊二醒的 洗漆液在2?8°C下解育過夜；使用洗漆液洗漆后在37°C下干燥12?2化，干燥后使用膜 封閉化ISA板，37°C保存。
[0043] 具體地，在上述的步驟1)中采用CIK細胞接種草魚出血病病毒具體包括W下步 驟：
[0044] a、在無菌條件下采用孔徑為10?100K的超濾膜對胎牛血清進行超濾，收集濾出 液，得到營養(yǎng)液；較佳的超濾膜孔徑為30K ;
[0045] b、采用M199培養(yǎng)基培養(yǎng)CIK細胞，長滿單層后加入膜蛋白酶進行消化，然后使用 移液管反復輕輕吹打成單細胞懸浮液，在25°C下按照體積比1:3接種傳代培養(yǎng)；
[0046] c、待CIK細胞生長至單層致密后接種0. 03M0I的草魚出血病病毒，加入步驟a所 制得的營養(yǎng)液后25°C下培養(yǎng)4?6天后獲得病毒懸浮液。
[0047] 具體地，在上述的步驟1)中所述的離屯、是將病毒懸浮液在4000?6000r/min的 轉(zhuǎn)速下進行離屯、，離屯、時間為20?60min，然后收集上清液。其中，較佳的方案中，離屯、轉(zhuǎn)速 為4500?6000r/min，離屯、時間為30?60min。
[0048] 將上述離屯、步驟后得到的上清液采用孔徑為10?300K的超濾膜進行超濾，收集 非濾出液，得到濃縮液。較佳的方案中超濾膜的孔徑為10?100K。
[0049] 具體地，在上述的步驟1)中的分子篩層析采用填料為Su