perdex? 200、填料高度 為20?80cm的層析柱；上樣前用PH為7. 2的0. Olmol/L磯酸鹽緩沖液平衡層析柱，然后 將體積為填料體積的5?20%的濃縮液上樣至層析柱中，使用PH為7. 2的0. Olmol/L磯酸 鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集第一洗脫峰樣品，得到初純液。
[0化0] 具體地，在上述的步驟1)中的陰離子交換層析采用填料為Cellufine Sul化te的 層析柱；上樣前用PH為7. 2的0. Olmol/L磯酸鹽緩沖液平衡層析柱，然后將初純液上樣至 層析柱中，使用0. 5mol/L化C1溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集第二洗脫峰樣品，得到精純液。 [0化1] 將經(jīng)陰離子交換層析得到的精純液采用孔徑為10?300K的超濾膜進(jìn)行超濾，收 集非濾出液，得到精純病毒液。較佳的方案中，超濾膜的孔徑為10?100K。
[0052] 在上述步驟4)中，封閉液的制備具體包括W下步驟：
[005引 A、在5?lOg明膠中加入200ml用超純水配制的PBS溶液，完全溶解后進(jìn)行濕熱 高壓滅菌，溫度為121°C、滅菌時(shí)間為20min ;
[0化4] B、滅菌結(jié)束后自然冷卻至常溫，加入0.25%膜酶溶液，37°C下消化8-2化；重復(fù)該 步驟1-3次后得到膜酶消化液；
[0055] C、使用孔徑為100K的超濾膜對膜酶消化液進(jìn)行超濾，收集濾出液；然后使用孔徑 為30K的超濾膜對上述濾出液進(jìn)行超濾，收集非超濾液，得到酶解膠原蛋白；
[0化6] D、將上述酶解膠原蛋白W 50?500 y g/ml的量加入到步驟3)所述洗漆液中，即 得封閉液。
[0057] 實(shí)施例1
[0化引草魚出血病病毒抗體化ISA檢測試劑盒，，按照W下方法制備而成的，具體包括W 下幾個(gè)步驟：
[0化9] 一、草魚出血病病毒的繁殖：
[0060] a、在無菌條件下采用孔徑為30K的超濾膜對胎牛血清進(jìn)行超濾，收集濾出液，得 到營養(yǎng)液；
[0061] b、在225cm2的方瓶中加入Gibco的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)CIK細(xì)胞，待CIK細(xì)胞長滿 單層后加入膜蛋白酶進(jìn)行消化，然后使用移液管反復(fù)輕輕吹打成單細(xì)胞懸浮液，在25°C下 按照體積比1:3接種傳代培養(yǎng)；
[0062] C、待CIK細(xì)胞生長形成致密的單層后接種0. 03M0I的草魚出血病病毒，加入10% 步驟a所制得的營養(yǎng)液后25°C下培養(yǎng)5天后獲得病毒懸浮液。
[0063] 二、草魚出血病病毒的純化
[0064] 1、離屯、超濾；將上述的病毒懸浮液在離屯、轉(zhuǎn)速為4500巧m、離屯、時(shí)間為30min的條 件下進(jìn)行離屯、，收集上清液；然后使用孔徑為100K的超濾膜對上清液進(jìn)行超濾，收集非濾 出液，得到濃縮液。
[00化]2、分子篩層析純化；采用Superdex? 200填料的層析柱進(jìn)行分子篩層析，填料裝 柱的高度為30cm ;使用抑為7. 2的0. Olmol/L磯酸鹽緩沖液平衡層析柱，然后將濃縮液上 樣至層析柱進(jìn)行層析，上樣的濃縮液體積為填料體積的5%;使用PH為7. 2的0. Olmol/L磯 酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集第一個(gè)洗脫峰樣品，即為草魚出血病病毒峰樣品，得到初純液； 濃縮液通過Superdex? 200分子篩層析的分離效果具體參見圖1，圖1中曲線表示濃縮液 中蛋白質(zhì)濃度；黑色箭頭表示草魚出血病病毒的洗脫峰。
[0066] 3、陰離子交換層析純化：采用填料為Cellufine Sul化te的層析柱進(jìn)行陰離子交 換層析；使用抑為7. 2的0. Olmol/L磯酸鹽緩沖液平衡層析柱，然后將初純液上樣至層析 柱進(jìn)行層析，然后用0. 5mol/L化C1溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集第二個(gè)洗脫峰樣品，即草魚出 血病病毒峰，得到精純液；初純液通過Cellufine Sul化te陰離子交換層析的分離效果具 體參見圖2,圖2中曲線表示初純液中蛋白質(zhì)濃度；黑色箭頭表示草魚出血病病毒的洗脫 峰。
[0067] 4、超濾純化；使用孔徑為10K的超濾膜對精純液進(jìn)行超濾濃縮，去除小分子物質(zhì)， 收集非濾出液，得到精純病毒液。
[0068] 為了考察上述不同的純化步驟對草魚出血病病毒純度的影響，分別對進(jìn)行上述純 化步驟前的病毒懸浮液及每個(gè)純化步驟結(jié)束后得到的液體測定病毒滴度、蛋白含量，結(jié)果 見表1。
[0069] 由表1可知，上述不同的純化步驟對草魚出血病病毒的純度均有不同的影響，其 中超濾、分子篩層析、陰離子交換層析對草魚出血病病毒的純度影響最大。本發(fā)明的草魚 出血病病毒經(jīng)過特殊培養(yǎng)方法和多個(gè)不同的純化步驟后，使得其最終能夠達(dá)到病毒滴度 (TCIDs。）為 l〇7'V〇. 1ml 時(shí)，蛋白含量僅為 95yg/ml。
[0070] 表1不同處理過程對草魚出血病病毒的純度影響
[0071]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種草魚出血病病毒抗體的ELISA檢測試劑盒，其特征在于：其包括鼠抗兔IgG的 酶標(biāo)記物、包被有草魚出血病病毒的ELISA板。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ELISA檢測試劑盒，其特征在于：該ELISA檢測試劑盒還包 括標(biāo)準(zhǔn)血清、洗滌液、TMB底物顯色液、終止液。
3. -種如權(quán)利要求1所述的草魚出血病病毒抗體的ELISA檢測試劑盒的制備方法，其 特征在于：其包括以下幾個(gè)步驟： DELISA板包被抗原的制備：采用CIK細(xì)胞接種草魚出血病病毒獲得病毒懸浮液；對病 毒懸浮液進(jìn)行離心、超濾濃縮后得到濃縮液，將濃縮液依次經(jīng)過分子篩層析、陰離子交換層 析、超濾濃縮后獲得精純病毒液； 2) 包被液的制備：包被液為0. 05mol/L磷酸鹽緩沖液，該包被液的pH為9?9. 8 ; 3) 洗滌液的制備：洗滌液為0. 15mol/L含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，該洗滌液的pH為 7. 4,吐溫-20的體積濃度為0. 05% ; 4) 封閉液的制備：在上述洗滌液中加入50?500 μ g/ml的酶解膠原蛋白，即得封閉 液； 5. ELISA板的制備：將步驟1)制得的精純病毒液加入到包被液中進(jìn)行稀釋至濃度為 0.5?10 μ g/ml的病毒蛋白稀釋液，將病毒蛋白稀釋液加入到ELISA板的每孔中，2?8°C 孵育過夜；然后使用洗滌液洗滌，接著向ELISA板每孔中加入100 μ 1封閉液后置于2?8°C 冰箱中孵育過夜；再使用洗滌液洗滌后，加入含有濃度為0. 5?2%的戊二醛的洗滌液在 2?8°C下孵育過夜；使用洗滌液洗滌后在37°C下干燥12?24h，干燥后使用膜封閉ELISA 板，37 °C保存。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：在步驟1)中采用CIK細(xì)胞接種草魚 出血病病毒具體包括以下步驟： a、 在無菌條件下采用孔徑為10?100K的超濾膜對胎牛血清進(jìn)行超濾，收集濾出液，得 到營養(yǎng)液； b、 采用M199培養(yǎng)基培養(yǎng)CIK細(xì)胞，長滿單層后加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，然后使用移液 管反復(fù)輕輕吹打成單細(xì)胞懸浮液，在25°C下按照體積比1:3接種傳代培養(yǎng)； c、 待CIK細(xì)胞生長至單層致密后接種0. 03M0I的草魚出血病病毒，加入步驟a所制得 的營養(yǎng)液后于25°C下培養(yǎng)4?6天后獲得病毒懸浮液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟1)中所述的離心是將病毒懸浮 液在4000?6000r/min的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心，離心時(shí)間為20?60min，然后收集上清液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：將上清液采用孔徑為10?300K的 超濾膜進(jìn)行超濾，收集非濾出液，得到濃縮液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：在步驟1)中的分子篩層析采用填料 為Superdex?200、填料高度為20?80cm的層析柱；上樣前用PH為7. 2的0. Olmol/L磷酸 鹽緩沖液平衡層析柱，然后將體積為填料體積的5?20%的濃縮液上樣至層析柱中，使用 PH為7. 2的0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集第一洗脫峰樣品，得到初純液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于：在步驟1)中的陰離子交換層析采用 填料為Cellufine Sulfate的層析柱；上樣前用PH為7. 2的0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液平衡 層析柱，然后將初純液上樣至層析柱中，使用0. 5mol/L NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集第二 洗脫峰樣品，得到精純液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于：將精純液采用孔徑為10?300K的 超濾膜進(jìn)行超濾，收集非濾出液，得到精純病毒液。
10. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：封閉液的制備具體包括以下步驟： A、 在5?IOg明膠中加入200ml用超純水配制的PBS溶液，完全溶解后進(jìn)行濕熱高壓 滅菌，溫度為121°C、滅菌時(shí)間為20min ; B、 滅菌結(jié)束后自然冷卻至常溫，加入0. 25%胰酶溶液，37°C下消化8-24h ;重復(fù)該步驟 1-3次后得到胰酶消化液； C、 使用孔徑為100K的超濾膜對胰酶消化液進(jìn)行超濾，收集濾出液；然后使用孔徑為 30K的超濾膜對上述濾出液進(jìn)行超濾，收集非超濾液，得到酶解膠原蛋白； D、 將上述酶解膠原蛋白以50?500 μ g/ml的量加入到步驟3)所述洗滌液中，即得封 閉液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種草魚出血病病毒抗體ELISA檢測試劑盒，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。發(fā)明從胎牛血清中分離分子量小于30～100K的蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)繁殖草魚出血病病毒，繁殖后對草魚出血病病毒采用孔徑為30～100K的濾膜進(jìn)行超濾，然后經(jīng)過分子篩層析、陰離子交換層析、超濾進(jìn)行進(jìn)一步的純化，獲得高純度的草魚出血病病毒；進(jìn)一步采用分子量大小為30～100K的酶解明膠蛋白作為ELISA板的封閉液封閉草魚出血病病毒等步驟制備了診斷草魚出血病病毒抗體的ELISA試劑盒。該試劑盒中ELISA板包被的草魚出血病病毒純度高，檢測更靈敏；經(jīng)過酶解膠原蛋白封閉、戊二醛固定、干燥后有效延長保存期。
【IPC分類】G01N33-569
【公開號(hào)】CN104569391
【申請?zhí)枴緾N201510049714
【發(fā)明人】陳瑞愛, 徐家華, 歐陽征亮, 蔣春英, 王新秋, 張東霞
【申請人】肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司, 廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月30日