同時測定馬錢素芍藥苷黃芩苷與黃芩素單體質(zhì)量濃度的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及用色譜法分析材料領域，具體是一種同時測定馬錢素芍藥苷黃芩苷與 黃芩素單體質(zhì)量濃度的方法。
【背景技術】
[0002] 天然中藥材山茱萸、白芍和黃芩是臨床使用率極高的3味中藥，這都源于其對人 體重要的藥理作用。而馬錢素、芍藥苷、黃芩苷和黃芩素正是山茱萸、白芍和黃芩發(fā)揮藥效 的主要活性成分。
[0003] 馬錢素屬于環(huán)烯醚萜苷類，是天然中藥材山茱萸的主要活性成分。中國藥典從 2005版起將其作為山茱萸的質(zhì)量控制指標之一。馬錢素具有升高血壓、擴張外周血管、改善 微循環(huán)的作用，因而能對抗ADP、AA及膠原誘發(fā)的血小板聚集及血栓的形成；通過抗氧化作 用，可降低肝、腦組織的過氧化脂質(zhì)含量，清除氧自由基而達到抗衰老的作用；通過增強非 特異性免疫功能，促進巨噬細胞吞噬功能，達到防癌、防輻射的作用；此外，馬錢素還具有較 好的抗炎、抗菌等功效，作為常用的中成藥物原料添加。
[0004] 芍藥苷屬于單萜類糖苷化合物，是天然中藥材芍藥的主要活性成分。具有抗自由 基損傷、抑制細胞內(nèi)鈣超載和抗神經(jīng)毒性等作用，體內(nèi)實驗證明其有降低血液粘度、抗血小 板聚集、擴張血管、改善微循環(huán)、抗氧化、降低血糖、抗驚厥等多種生物學效應，且毒副作用 較小?，F(xiàn)經(jīng)國內(nèi)外學者進一步研究證實，其具有神經(jīng)保護作用，機制暫且不明。但是，芍藥 苷作為芍藥總苷的主要活性成分卻已是不爭的事實。
[0005] 黃芩苷與黃芩素屬于黃酮類化合物，是中藥材黃芩的主要有效成分。它們均有廣 泛的抗菌作用，對抗艾滋病病毒（HIV)及防止HIV-I攻擊靶細胞等均有獨特的療效；黃芩苷 及黃芩素可通過多種環(huán)節(jié)影響花生四烯酸代謝，不同程度地抑制前列腺素 E (PGE)和白三 烯（LT)等炎性介質(zhì)的生成，起到抗炎的功效；此外，黃芩苷與黃芩素還具有抗毒素、解熱、 保肝、利膽、降脂及免疫抑制作用等。
[0006] 綜上，研究同時檢測馬錢素、芍藥苷、黃芩苷和黃芩素質(zhì)量濃度的檢測方法，對保 證以此四種單體質(zhì)量濃度為質(zhì)量檢測指標的中藥制劑，確保臨床用藥等具有非常重要的價 值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有技術中不能同時測定馬錢素、芍藥苷、黃芩苷和黃芩素的 質(zhì)量濃度，而提供的一種同時測定馬錢素芍藥苷黃芩苷與黃芩素單體質(zhì)量濃度的方法。
[0008] 本發(fā)明是按照以下技術方案實現(xiàn)的。
[0009] -種同時測定馬錢素芍藥苷黃芩苷與黃芩素單體質(zhì)量濃度的方法，其特征在于： 包括以下步驟： a.樣品的預處理 干燥至恒重的山茱萸、白芍、黃芩，粉碎后過40目篩，按重量份數(shù)比分別稱取山茱萸 4. 5份、黃芩1份、白芍4. 5份，混合后加入100份的甲醇，超聲波提取，濾液過0. 22 μ m微孔 濾膜，進樣量3~9μ 1 ; 供試樣品缺山茱萸陰性對照溶液的制備：精稱黃芩1份、白芍4. 5份，加入55份的甲 醇，提取、制備、進樣量同上； 供試樣品缺黃芩陰性對照溶液的制備：精稱山茱萸1份、白芍1份，加入20份的甲醇， 提取、制備、進樣量同上； 供試樣品缺白芍陰性對照溶液的制備：精稱山茱萸4. 5份、黃芩1份，加入55份的甲 醇，提取、制備、進樣量同上； b.高效液相色譜操作條件 色譜柱：150 X46 mm，5 μπι，ZORBAX SB-C18;流動相為乙腈：0.1%磷酸水溶液，梯度 洗脫：〇?15 min時，乙腈為14%?16. 5% ; 15?30 min時，乙腈為16. 5%?80% ;30?31 min時，乙腈為80%?14% ;波長在0?15 min時為236 nm，在15?30 min時為278 nm， 在30?31 min時為平衡；體積流量0· 8~L 2 mL/min ;柱溫25~40 °C ; 超聲波提取的條件為2501，401(取，201：，超生提取301^11; c. 工作曲線的制備 分別精密稱取馬錢素對照品〇. 82 mg、芍藥苷對照品1. 03 mg、黃芩苷對照品0. 96 mg、 黃芩素對照品〇. 29 mg，配成ImL的甲醇混合對照品溶液，并進行倍比稀釋，共得到四種單 體混合對照品稀釋溶液的12個質(zhì)量濃度，取后9個質(zhì)量濃度進樣測定的峰面積與對應濃度 繪制標準曲線；各質(zhì)量濃度液體分別過〇. 22 μ m微孔濾膜，進樣5μ L進行色譜分析，以峰 面積J對濃度竊|行線性回歸，同時得到四種單體成分工作曲線； d. 四種單體成分的色譜分離及含量的測定 將經(jīng)過預處理的山茱萸、白芍、黃芩樣品進行上機測定，對馬錢素、芍藥苷、黃芩苷、黃 芩素四種單體成分進行色譜分離，并根據(jù)供試樣品中每個中藥單體成分對應的峰面積由相 應的工作曲線分別計算出四種單體成分的含量。
[0010] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明通過高效液相色譜法采用梯度洗脫、變換波長，同時檢測馬錢素、芍藥苷、黃芩 苷和黃芩素，本發(fā)明方法操作簡單，靈敏度高，重復性佳，檢測時間短，得到的色譜峰形對稱 性好，分離度佳，達到基線分離，實驗數(shù)據(jù)準確可靠，提供了一種良好的質(zhì)控檢測手段。
【附圖說明】
[0011] 圖1是本發(fā)明對照樣品高效液相色譜圖； 圖2是本發(fā)明供試樣品高效液相色譜圖； 圖3是本發(fā)明供試樣品缺山茱萸的陰性對照溶液高效液相色譜圖； 圖4為本發(fā)明供試樣品缺黃芩的陰性對照溶液高效液相色譜圖； 圖5為本發(fā)明供試樣品缺白芍的陰性對照溶液高效液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0012] 下面結合附圖及實施例對本發(fā)明進行詳細說明。
[0013] 1.儀器與材料 1. 1儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀，包括四元泵，G1311C、自動進樣器，G1329B、VWD檢測 器，G1314F、色譜工作站，安捷倫科技有限公司； AE240精密電子分析天平，梅特勒一上海托利多儀器； 超純水器，法國MILLIP0RE ; 萬能粉碎機，北京中興偉業(yè)儀器有限公司制造； 超聲提取器，寧波新藝生物科技股份有限公司； 電熱鼓風干燥箱，天津市三水科學儀器有限公司。
[0014] 1. 2 材料 馬錢素對照品，中國藥品生物制品檢定所，質(zhì)量分數(shù)不少于99. 9%，批號20140309 ; 芍藥苷，中國藥品生物制品檢定所，質(zhì)量分數(shù)不少于99. 9%，批號20130606 ; 黃芩苷，中國藥品生物制品檢定所，質(zhì)量分數(shù)不少于99. 9%，批號20140516 ; 黃芩素，中國藥品生物制品檢定所，質(zhì)量分數(shù)不少于99. 9%，批號20140126 ; 乙腈(色譜純)，德國Merk公司； 磷酸(色譜純)，天津市光復精細化工研究所； 甲醇(色譜純)，德國Merk公司； 實驗用水為二次純化水，天津市第一中心醫(yī)院藥廠提供； 白芍藥材，中國安國市昌達中藥材飲片有限公司，產(chǎn)品批號：1405001 ; 山茱萸藥材，中國安國市昌達中藥材飲片有限公司，產(chǎn)品批號：1206001 ; 黃芩藥材，中國安國市昌達中藥材飲片有限公司，產(chǎn)品批號=1309001。
[0015] 2.實驗方法與結果 2.1樣品的預處理 干燥至恒重的山茱萸、白芍、黃芩粉碎后過40目篩，備用。
[0016] 供試樣本的制備：精稱山茱萸0.045g、黃芩O.Olg、白芍0.045g放于2ml EP管中， 加甲醇lml。在250W，40KHz，2(TC實驗條件下，超生提取30min。濾液過0. 22μπι微孔濾膜， 進樣5 μ L0
[0017] 供試樣品缺山茱萸陰性對照溶液的制備：精稱黃芩0. 02g、白芍0. 09g放于2ml EP 管中，加甲醇I. lml。在250W，40KHz，20°C實驗條件下，超生提取30min。濾液過0. 22μπι微 孔濾膜，進樣5 μ L。
[0018] 供試樣品缺黃芩陰性對照溶液的制備：精稱山茱萸0. 〇45g、白芍0. 045g放于2ml EP管中，加甲醇0. 9ml。在250W，40KHz，20°C實驗條件下，超生提取30min。濾液過0. 22 μ m 微孔濾膜，進樣5 μ L。
[0019] 供試樣品缺白芍陰性對照溶液的制備：精稱山茱萸0. 09g、黃芩0. 02g放于2ml EP 管中，加甲醇I. lml。在250W，40KHz，20°C實驗條件下，超生提取30min。濾液過0. 22μπι微 孔濾膜，進樣5 μ L。
[0020] 2. 2色譜條件 色譜柱：150 Χ46 mm，5 μπι，Z0RBAX SB-C18;流動相為乙腈：0.1%磷酸水溶液，梯度 洗脫：〇?15 min時，乙腈為14%?16. 5% ; 15?30 min時，乙腈為16. 5%?80% ;30?31 min時，乙腈為80%?14% ;波長在O?15 min時為236 nm，在15?30 min時為278 nm， 在30?31 min時為平衡；體積流量I. OmL/min ;柱溫30°C。
[0021] 2.3工作曲線的制備 分別精密稱取馬錢素對照品〇. 82 mg、芍藥苷對照品1. 03 mg、黃芩苷對照品0. 96 mg、 黃芩素對照品〇. 29 mg，配成ImL的甲醇混合對照品溶液，并進行倍比稀釋，共得到四種單 體混合對照品稀釋溶液的12個質(zhì)量濃度，取后9個質(zhì)量濃度并進樣測定的峰面積與對應濃 度同時得到四種單體成分的工作曲線。
[0022] 2.3.1馬錢素工作曲線 在得到的四種單體混合對照品稀釋溶液的各12個質(zhì)量濃度中，得到馬錢素稀釋溶液 的質(zhì)量濃度為 546. 667、273· 333、136· 667、68· 333、34· 167、17· 083、8· 542、4· 270、2· 135、 I. 068、0. 534、0. 267mg/L ;取后9個質(zhì)量濃度并進樣測定的峰面積與對應濃度繪制標準曲 線；各質(zhì)量濃度液體分別過0.22 μπι微孔濾膜，進樣5 yL進行色譜分析；以峰面積淑寸濃 度C(mg/L)進行線性回歸，得馬錢素工作曲線：A=17. 850C+13. 141 r=0. 9997 ;馬錢素在質(zhì) 量濃度68. 333?0. 267 mg/L之間與峰面積呈良好的線性關系；按照信噪比3/1，馬錢素最 低檢測質(zhì)量濃度為4. 865 μ g/L。
[0023] 2.3.2芍藥苷工作曲線 在得到的四種單體混合對照品稀釋溶液的各12個質(zhì)量濃度中，得到芍藥苷稀釋溶液 的質(zhì)量濃度為 686. 667、343· 333、171· 667、85· 833、42· 917、21· 458、10· 729、5· 365、2· 682、 I. 341、0. 671、0. 335mg/L ;取后9個質(zhì)量濃度并進樣測定的峰面積與對應濃度繪制標準曲 線；各質(zhì)量濃度液體分別過0.22 μπι微孔濾膜，進樣5 yL進行色譜分析；以峰面積淑寸濃 度C(mg/L)進行線性回歸，得芍藥苷工作曲線：A=14. 598C+12. 659 r=0. 9997 ;芍藥苷在質(zhì) 量濃度85. 833?0. 335 mg/L之間與峰面積呈良好的線性關系；按照信噪比3/1，芍藥苷最 低檢測質(zhì)量濃度為9. 180 μ g/L。
[0024] 2.3.3黃芩苷工作曲線 在得到的四種單體混合對照品