檢測(cè)人血小板GSK-3β蛋白活性的斑點(diǎn)印跡方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及能檢測(cè)人血小板GSK-3 β蛋白活性的斑點(diǎn)印跡方法。
【背景技術(shù)】
[0002]糖原合酶激酶3 (Glycogen Synthase Kinase 3，GSK-3)是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，普遍存在于哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞中。GSK-3是胰島素依賴性糖原合成的重要調(diào)節(jié)因子，還能作用于眾多信號(hào)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、存活和凋亡。
[0003]GSK-3主要有兩種亞型，即GSK-3 α和GSK-3 β，分子量分別為5IkDa和47kDa，二者在催化區(qū)域具有98%的同源性，于N-和C-末端略有不同。盡管GSK-3的兩個(gè)亞型都參與了神經(jīng)精神失調(diào)，大多數(shù)研宄集中于其β亞型。GSK-30磷酸化是研宄最多的調(diào)節(jié)方式。GSK-3 0的正調(diào)節(jié)因子是第216位酪氨酸殘基，該位點(diǎn)的磷酸化是GSK-3 0活性的基礎(chǔ)，該殘基高度磷酸化導(dǎo)致GSK-3 0在靜止細(xì)胞的激活。GSK-3 0的負(fù)調(diào)節(jié)因子是第9位蘇氨酸，該位點(diǎn)磷酸化可導(dǎo)致GSK-3 0失活。GSK-30在腦組織高表達(dá)，廣泛分布，尤其在海馬區(qū)域，參與突觸可塑性、神經(jīng)極性、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)穩(wěn)態(tài)調(diào)控。臨床研宄證明，GSK-3 β參與阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病、精神分裂癥、雙向情感障礙等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的進(jìn)程。
[0004]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，腦GSK-3 β的過度活化與tau蛋白過度磷酸化以及動(dòng)物的空間記憶損傷呈顯著正相關(guān)。但對(duì)人外周血液中GSK-3 0蛋白的活性缺乏理想監(jiān)測(cè)方法。因此，研宄對(duì)患者血小板中GSK-30蛋白及酶活表達(dá)的檢測(cè)方法，可望為臨床疾病早期篩選、診斷提供科學(xué)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的任務(wù)是提供一種能檢測(cè)人血小板GSK-3 β蛋白活性的斑點(diǎn)印跡(Dot-blot)方法。所述的Dot-blot方法是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法。所述的方法依據(jù)抗原、抗體結(jié)合反應(yīng)原理，可以被利用作蛋白質(zhì)簡(jiǎn)單快速的定量分析。
[0006]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體方案是:
[0007]本發(fā)明提供的檢測(cè)人血小板糖原合酶激酶3 β蛋白活性的方法，包括以下步驟:
[0008](I)血小板分離與純化:人全血5ml，60g離心力，4攝氏度離心15min，上層是血楽，中層是白細(xì)胞，下層是紅細(xì)胞；取上層成分血楽，60g離心力，4攝氏度離心15min，去沉淀，1500g離心15min，分為2層，上層為血清，下層為血小板；血小板標(biāo)本用改良臺(tái)氏液洗滌，1500g離心5min3次，儲(chǔ)存于_80°C冰箱；
[0009](2)血小板蛋白提取與濃度測(cè)定:血小板加入預(yù)冷的裂解液120 μ I 2XBuffer,所述的 2XBuffer 由 50mM Tris-Cl pH 8.0、I % NP-40、150mM NaCl.0.1 % SDS.0.02 %NaNR3R、20%甘油、cocktail、I % PMSF組成，在冰上靜置20min后，將蛋白樣品置于沸水中煮1min使其蛋白充分變性，60hz超聲15秒，BCA法測(cè)定蛋白濃度；
[0010](3)血小板蛋白斑點(diǎn)印跡測(cè)定:血小板樣品配置成統(tǒng)一濃度為5ug/ul，將2ul樣品點(diǎn)于硝酸纖維素膜NC膜上，將NC膜晾干Ι-a后，置于含5%脫脂奶粉的封閉液中，搖床上室溫封閉30-60min，取出NC膜，用雙蒸水沖洗干凈，加入對(duì)應(yīng)的一抗，所述的對(duì)應(yīng)的一抗為含 I % BSA 的 TBS 稀釋的 1:1000GSK-3 β 和 Ser9_GSK_3 β，4°C過夜。I X TBST 緩沖液洗NC 膜 3 次，每次 5min，所述的 I XTBST 含 10mM NaCl、50mM Tris,0.5% Tween 20,pH 7.4，接著用雙蒸水清洗掉泡沫，用Licor公司標(biāo)記IRDyeT 800通道的熒光二抗染料，所述的二抗用含I % BSA的TBS稀釋為1:10000的抗體。室溫下封膜孵育lh，I X TBST緩沖液洗膜3次，每次1min ;雙蒸水沖洗泡沫，熒光掃描、顯色，分別測(cè)出GSK-3I3和Ser9_GSK_3 β的灰度值，得到反映GSK-3 β活性的Ser9-GSK-3 β /GSK-3 β比值。
[0011]本發(fā)明的特點(diǎn)是:建立的血小板GSK-30蛋白活性的檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確快捷，并可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，用于半定量分析。所構(gòu)建的Dot-blot方法檢測(cè)了血小板GSK-3 0蛋白及活性位點(diǎn)的表達(dá)，與Western Blot結(jié)果基本一致，說明建立的血小板GSK-3 β蛋白活性測(cè)定是簡(jiǎn)便、快捷、實(shí)用的評(píng)估方法。
[0012]實(shí)驗(yàn)資料
[0013]實(shí)驗(yàn)名稱:斑點(diǎn)印跡法檢測(cè)的2型糖尿病(T2DM)組、T2DM并MCI患者血小板GSK-3 β活性比較
[0014]實(shí)驗(yàn)方法及步驟:
[0015]一、實(shí)驗(yàn)方法:①入選標(biāo)準(zhǔn):年齡>50歲糖尿病患者；無明顯影響認(rèn)知測(cè)試的視力、聽力障礙；無嚴(yán)重低血糖、糖尿病酮癥昏迷、高滲性昏迷病史；無酒精依賴及精神活性物質(zhì)濫用病史；無腦外傷，無心腦血管事件發(fā)生，包括腦梗塞、腦出血、ΤΙΑ、心肌梗塞等；無影響認(rèn)知測(cè)試的其他嚴(yán)重軀體疾病，如癲癇、甲狀腺機(jī)能減退癥、低氧血癥等；無精神病史；自愿參加本研宄，能配合檢查，依從性好。②研宄分組:2型糖尿病無認(rèn)知功能障礙T2DM組(T2DM)，2型糖尿病并輕度認(rèn)知功能障礙MCI組(T2DM-MCI)。兩組年齡、性別、糖尿病病程、合并高血壓比例、合并高脂血癥比例、合并冠心病比例、并發(fā)癥比例(糖尿病周圍神經(jīng)病變、糖尿病血管病變、視網(wǎng)膜病變等)、應(yīng)用胰島素治療比例均匹配。③研宄指標(biāo):簡(jiǎn)易智力狀態(tài)檢查量表(MMSE) ,Western Blot,Dot Blot 檢測(cè)血小板 GSK-3 β (Total) ,GSK-3 β (S9)活性。
[0016]二、實(shí)驗(yàn)步驟:
[0017]①血小板分離與純化。人全血5ml，60g離心力，4攝氏度離心15min，上層是血漿，中層是白細(xì)胞，下層是紅細(xì)胞。取上層成分血楽，60g離心力，4攝氏度離心15min，去沉淀，1500g離心15min，分為2層，上層為血清，下層為血小板。血小板標(biāo)本用改良臺(tái)氏液洗滌，1500g離心5min3次，儲(chǔ)存于-80°C冰箱；
[0018]②血小板蛋白提取與濃度測(cè)定。血小板加入預(yù)冷的裂解液120 μ I 2XBuffer,所述的 2XBuffer 為 50mM Tris-Cl pH 8.0、I % NP-40、150mM NaCl.0.1 % SDS.0.02 %NaNR3R、20%甘油、cocktail、l% PMSF，在冰上靜置20min后，將蛋白樣品置于沸水中煮1min使其蛋白充分變性，60hz超聲15秒，BCA法測(cè)定蛋白濃度；
[0019]③血小板蛋白Dot-blot測(cè)定。血小板樣品配置成統(tǒng)一濃度為5ug/ul，將2ul樣品點(diǎn)于硝酸纖維素膜NC膜上。NC膜晾干l_2h后，置于含5%脫脂奶粉的封閉液中，搖床上室溫封閉30-60min。取出NC膜，用雙蒸水沖洗干凈，加入1:1000的GSK-3 β和Ser9_GSK_3 β一抗，4°C過夜。I XTBST緩沖液洗NC膜3X5min，接著用雙蒸水清洗掉泡沫。用Licor公司標(biāo)記IRDyeT 800通道的1:10000熒光二抗染料室溫下封膜孵育lh。I XTBST緩沖液洗膜3次，每次lOmin，同樣用雙蒸水沖洗泡沫，熒光掃描。
[0020] 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0021 ] ⑴T2DM和T2DM-MCI組血小板GSK-3 β活性
[0022]血小板Dot Blot結(jié)果顯示，糖尿病合并輕度認(rèn)知障礙T2DM-MCI患者血小板GSK-3 β (ser9)較單純T2DM患者表達(dá)下降，活性增高，但二者GSK-3I3總蛋白表達(dá)無明顯差異，見圖1。
[0023](2)血小板 GSK-3 β 的 Dot Blot 與 Western Blot 比較
[0024]血小板Western Blot與Dot Blot結(jié)果基本一致，糖尿病合并輕度認(rèn)知障礙(T2DM-MCI)組GSK-313 (ser9)較單純T2DM患者表達(dá)下降，活性增高，二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但二組GSK-30總蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖2。
[0025](3)不同患者血小板Dot Blot與Western Blot比較
[0026]不同患者血小板Western Blot與Dot Blot結(jié)果基本一致，見圖3。
[0027]四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論:糖尿病合并輕度認(rèn)知障礙T2DM-MCI患者較單純T2DM患者血小板GSK-3 β活性增高。斑點(diǎn)印跡Ser9-GSK-3 β /GSK-3 β的比值可以較好反映GSK-3 β蛋白活性，可用于對(duì)GSK-3 β蛋白活性進(jìn)行簡(jiǎn)單快速的定量分析。
【附圖說明】
[0028]圖1是Dot-blot檢測(cè)T2DM和T2DM-MCI組血小板GSK-3 β活性圖，圖中顯示糖尿病合并輕度認(rèn)知障礙T2DM-MCI患者血小板GSK-313 (ser9) /GSK-3 β比值較單純T2DM患者下降，活性增高，說明斑點(diǎn)印跡可以檢測(cè)GSK-30蛋白的相對(duì)活性。
[0029]圖2是免疫印跡檢測(cè)T2DM和T2DM-MCI組血小板GSK-3 β活性圖，糖尿病合并輕度認(rèn)知障礙(T2DM-MCI)組GSK-3 0 (ser9) /GSK-3 β比值較單純T2DM患者