下降，活性增高，說明Dot Blot與免疫印跡結(jié)果基本一致，但Dot-blot方法更簡單、實用。
[0030]圖3是Dot-blot、免疫印跡檢測T2DM和T2DM-MCI組血小板GSK-3 β活性比較圖，圖中顯示不同患者血小板Western Blot與Dot Blot結(jié)果基本一致，說明Dot Blot可以較好檢測GSK-3 β蛋白的相對活性。
【具體實施方式】
[0031]實施例1本發(fā)明Dot-blot方法的建立
[0032]1.血小板分離與純化。
[0033]1.1人全血5ml，60g，4攝氏度離心15min，上層是血楽，中層是白細胞，下層是紅細胞。血楽，60g，4攝氏度離心15min，去沉淀，1500g離心15min，分為2層，上層為血清，下層為血小板。
[0034]1.2血小板標(biāo)本用改良臺氏液洗滌，1500g離心5min3次，儲存于_80°C冰箱。
[0035]2.血小板蛋白提取與濃度測定。
[0036]2.1血小板加入預(yù)冷的裂解液120 μ I 2XBuffer,所述的2XBuffer由50mMTris-Cl pH 8.0、I % NP-40、150mM NaCl、0.1 % SDS、0.02% NaNR3R、20%甘油、cocktail、1% PMSF組成，在冰上靜置20min后，將蛋白樣品置于沸水中煮1min使其蛋白充分變性，60hz超聲15秒。
[0037]2.2 BCA法測定蛋白濃度。
[0038]3.血小板蛋白Dot-blot測定。
[0039]3.1血小板樣品配置成統(tǒng)一濃度為5ug/ul，將2ul樣品點于硝酸纖維素膜NC膜上。
[0040]3.2 NC膜晾干l_2h后，置于含5%脫脂奶粉的封閉液中，搖床上室溫封閉30—60mino
[0041]3.3取出NC膜，用雙蒸水沖洗干凈，加入對應(yīng)的I ;1000 —抗GSK-3 β和Ser9-GSK-3 β，4°C 過夜。
[0042]3.4 IXTBST緩沖液洗NC膜3次，每次5min，接著用雙蒸水清洗掉泡沫。
[0043]3.5用Licor公司標(biāo)記IRDyeT 800通道的1:10000熒光二抗染料溫下封膜孵育Iho IXTBST緩沖液洗膜3次，每次lOmin，同樣用雙蒸水沖洗泡沫。
[0044]3.6焚光掃描。
[0045]實施例2
[0046]斑點印跡法檢測的2型糖尿病(T2DM)組、T2DM并MCI患者血小板GSK-3 β活性比較
[0047]一、實驗方法:①入選標(biāo)準(zhǔn):年齡>50歲糖尿病患者；無明顯影響認知測試的視力、聽力障礙；無嚴重低血糖、糖尿病酮癥昏迷、高滲性昏迷病史；無酒精依賴及精神活性物質(zhì)濫用病史；無腦外傷，無心腦血管事件發(fā)生，包括腦梗塞、腦出血、ΤΙΑ、心肌梗塞等；無影響認知測試的其他嚴重軀體疾病，如癲癇、甲狀腺機能減退癥、低氧血癥等；無精神病史；自愿參加本研宄，能配合檢查，依從性好。②研宄分組:2型糖尿病無認知功能障礙T2DM組(T2DM)，2型糖尿病并輕度認知功能障礙MCI組(T2DM-MCI)。兩組年齡、性別、糖尿病病程、合并高血壓比例、合并高脂血癥比例、合并冠心病比例、并發(fā)癥比例(糖尿病周圍神經(jīng)病變、糖尿病血管病變、視網(wǎng)膜病變等)、應(yīng)用胰島素治療比例均匹配。③研宄指標(biāo):簡易智力狀態(tài)檢查量表(MMSE) ,Western Blot,Dot Blot 檢測血小板 GSK-3 β (Total) ,GSK-3 β (S9)活性。
[0048]二、實驗步驟:
[0049]①血小板分離與純化。人全血5ml，60g離心力，4攝氏度離心15min，上層是血楽，中層是白細胞，下層是紅細胞。取上層成分血楽，60g離心力，4攝氏度離心15min，去沉淀，1500g離心15min，分為2層，上層為血清，下層為血小板。血小板標(biāo)本用改良臺氏液洗滌，1500g離心5min3次，儲存于-80°C冰箱；
[0050]②血小板蛋白提取與濃度測定。血小板加入預(yù)冷的裂解液120 μ I 2XBuffer所述的 2XBuffer 為 50mM Tris-Cl pH 8.0、I % NP-40、150mM NaCl.0.1 % SDS.0.02 %NaNR3R、20%甘油、cocktail、l% PMSF，在冰上靜置20min后，將蛋白樣品置于沸水中煮1min使其蛋白充分變性，60hz超聲15秒，BCA法測定蛋白濃度；
[0051]③血小板蛋白Dot-blot測定。血小板樣品配置成統(tǒng)一濃度為5ug/ul，將2ul樣品點于硝酸纖維素膜NC膜上。NC膜晾干l_2h后，置于含5%脫脂奶粉的封閉液中，搖床上室溫封閉30-60min。取出NC膜，用雙蒸水沖洗干凈，加入1:1000的GSK-3 β和Ser9_GSK_3 β一抗，4°C過夜。I X TBST緩沖液洗NC膜3次，每次5min，接著用雙蒸水清洗掉泡沫。用Licor公司標(biāo)記IRDyeT 800通道1:10000的熒光二抗染料室溫下封膜孵育lh。I XTBST緩沖液洗膜3X lOmin，同樣用雙蒸水沖洗泡沫，熒光掃描、顯色。
[0052]三、實驗結(jié)果:
[0053]⑴T2DM和T2DM-MCI組血小板GSK-3 β活性
[0054]血小板Dot Blot結(jié)果顯示，糖尿病合并輕度認知障礙T2DM-MCI患者血小板GSK-3 β (ser9)較單純T2DM患者表達下降，活性增高，但二者GSK-3I3總蛋白表達無明顯差異，見圖1。
[0055](2)血小板 GSK-3 β 的 Dot Blot 與 Western Blot 比較
[0056]血小板Western Blot與Dot Blot結(jié)果基本一致，糖尿病合并輕度認知障礙(T2DM-MCI)組GSK-313 (ser9)較單純T2DM患者表達下降，活性增高，二者比較有統(tǒng)計學(xué)意義。但二組GSK-30總蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異，見圖2。
[0057](3)不同患者血小板Dot Blot與Western Blot比較
[0058]不同患者血小板Western Blot與Dot Blot結(jié)果基本一致，見圖3。
[0059]四、實驗結(jié)論:糖尿病合并輕度認知障礙T2DM-MCI患者較單純T2DM患者血小板GSK-3 β活性增高。斑點印跡Ser9-GSK-3 β /GSK-3 β的比值可以較好反映GSK-3 β蛋白活性，可用于對GSK-3 β蛋白活性進行簡單快速的定量分析。
【主權(quán)項】
1.一種檢測人血小板糖原合酶激酶3 β蛋白活性的方法，包括以下步驟: (1)血小板分離與純化:人全血5ml，60g離心力，4攝氏度離心15min，上層是血楽，中層是白細胞，下層是紅細胞；取上層成分血楽，60g離心力，4攝氏度離心15min，去沉淀，.1500g離心15min，分為2層，上層為血清，下層為血小板；血小板標(biāo)本用改良臺氏液洗滌，.1500g離心5min3次，儲存于-80°C冰箱； (2)血小板蛋白提取與濃度測定:血小板加入預(yù)冷的裂解液120μ I 2XBuffer，所述的 2XBuffer 由 50mM Tris-Cl pH 8.0、I % NP-40、150mM NaCl、0.1 % SDS、0.02% NaNR3R、.20%甘油、cocktail、I % PMSF組成，在冰上靜置20min后，將蛋白樣品置于沸水中煮1min使其蛋白充分變性，60hz超聲15秒，BCA法測定蛋白濃度； (3)血小板蛋白斑點印跡測定:血小板樣品配置成統(tǒng)一濃度為5ug/ul，將2ul樣品點于硝酸纖維素膜NC膜上，將NC膜晾干l-2h后，置于含5%脫脂奶粉的封閉液中，搖床上室溫封閉30-60min，取出NC膜，用雙蒸水沖洗干凈，加入對應(yīng)的一抗，所述的對應(yīng)的一抗為含I % BSA 的 TBS 稀釋的 1:1000GSK-3 β 和 Ser9_GSK_3 β，4°C過夜。I X TBST 緩沖液洗 NC 膜.3 次，每次 5min，所述的 IXTBST 含 10mM NaCU50mM Tris,0.5% Tween 20、pH 7.4，接著用雙蒸水清洗掉泡沫，用Licor公司標(biāo)記IRDyeT 800通道的熒光二抗染料，所述的二抗用含I % BSA的TBS稀釋為1:10000的抗體。室溫下封膜孵育lh，I X TBST緩沖液洗膜3次，每次1min ;雙蒸水沖洗泡沫，熒光掃描、顯色，分別測出GSK-3 β和Ser9_GSK_3 β的灰度值，得到反映GSK-3 β活性的Ser9-GSK-3 β /GSK-3 β比值。
【專利摘要】本發(fā)明提供了檢測人血小板GSK-3β蛋白活性的斑點印跡方法。該斑點印跡方法是將血小板蛋白質(zhì)配置成統(tǒng)一濃度，樣品點于NC膜上，晾干，5％脫脂奶粉封閉，然后分別加入1:1000GSK-3β和Ser9-GSK-3β的一抗，洗脫后加Licor公司標(biāo)記IRDyeT 800通道的1:10000熒光二抗，洗脫后熒光掃描。該方法依據(jù)抗原、抗體結(jié)合反應(yīng)原理，對GSK-3β蛋白活性進行簡單快速的定量分析，可用于老年性癡呆的診斷和預(yù)防。
【IPC分類】G01N33-68
【公開號】CN104698188
【申請?zhí)枴緾N201510095987
【發(fā)明人】王建枝, 徐志鵬
【申請人】華中科技大學(xué)
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月4日