一種血清代謝組學分析模型的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種血清代謝組學分析模型，通過該模型可以方便、快捷對食管癌進 行早期初步篩查，屬于分析技術領域。
【背景技術】
[0002] 食管癌（esophagealcancer)是由食管鱗狀上皮或腺上皮的異常增生所形成的惡 性病變，是由不典型增生到癌的逐漸演變的過程。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新數(shù)據(jù)表明：全世界每 年約有40萬人死于食管癌，我國是食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，且90%患者的組織 類型為鱗狀細胞癌。山東省汶河流域為食管癌高發(fā)區(qū)，以肥城市、寧陽縣和汶上縣最高，發(fā) 病率分別為93. 95/10萬、88. 68/10萬和62. 26/10萬，遠高于全國一般水平（16. 7/10萬)， 尤其是肥城市，其發(fā)病率為山東省平均水平的3. 7倍，占到全縣腫瘤死因的50%。食管癌的 高發(fā)病率和高死亡率給我國尤其是山東省汶河流域造成了巨大的疾病負擔和經(jīng)濟負擔，已 經(jīng)成為嚴重的公共衛(wèi)生問題，亟待解決。
[0003] 食管癌的病因復雜，多數(shù)學者認為是基因與環(huán)境共同作用的結果，食管癌發(fā)病的 地域聚集性提示其與環(huán)境因素及不良生活習慣相關，如膳食成分中維生素與微量元素缺 乏、進食含亞硝胺類較多的食物、如喜歡腌制酸菜或霉變食品、長期喜進燙食、吸煙、飲酒不 良嗜好等。分子學研究表明食管癌的發(fā)生是多因素、多階段、多基因變異的積累以及各因素 與環(huán)境因素相互作用的結果，涉及眾多原癌基因、抑癌基因以及蛋白質的改變，以及細胞周 期。從癌前病變到食管癌的發(fā)生往往會經(jīng)歷漫長的過程，食管癌的重要癌前病變?yōu)槭彻荀[ 狀上皮輕、中、重度不典型增生，由輕度不典型增生到癌變一般需要幾年甚至十幾年。如果 在此期間，癌前病變?nèi)巳焊淖儾涣忌盍晳T、進行預防性服藥，那么將大大降低其癌變的幾 率。因此，食管癌癌前病變的早期識別和干預對降低其癌變率顯得尤為重要。
[0004] 為篩查處于輕度、中度和重度不典型增生的癌前病變狀態(tài)或早期食管癌的病例， 國家自2008年起在山東省肥城市(全國食管癌早診早治示范基地)，針對示范基地內(nèi)的所 有40~69歲的人群，借助胃鏡下碘染色指示性活檢技術，開展了食管癌早診早治項目。食 管內(nèi)鏡碘染色檢查后對可疑粘膜活檢并進行組織病理學檢查，是目前食管癌高發(fā)區(qū)普查、 高危人群篩檢和早期診斷中的金標準方法。由于其直觀，圖像淸晰且特異性高，目前還沒 有一種方法能替代其地位。雖然該方法準確度高，但仍具有一定的局限性：胃鏡為有創(chuàng)檢 查，且受檢者感覺痛苦，在執(zhí)行過程中有不依從現(xiàn)象；胃鏡下碘染色指示性活檢技術操作 復雜、成本較高，如果在高發(fā)的示范區(qū)之外推廣的可行性及效率仍有待商榷；食管癌高發(fā) 區(qū)的碘染色陽性率不到10%，高達90%的待篩查人群要承受有創(chuàng)胃鏡檢查的痛苦，還給國 家早診早治項目帶來了不必要的經(jīng)濟負擔。因此，急需開發(fā)一種新的更簡便的方法，探尋 在食管癌發(fā)生發(fā)展階段機體內(nèi)環(huán)境的變化，為食管癌的金標準篩檢方法（即胃鏡下碘染色 指示性活檢技術）提供初篩的科學依據(jù)和轉化醫(yī)學支持，以區(qū)分碘染色陰性和碘染色陽性 人群，從而避免碘染色陰性人群承受有創(chuàng)胃鏡的痛苦并減少早診早治項目的財政支出。此 外，在食管癌早診早治項目早期曾試行使用哈佛癌癥風險預測模型（問卷涉及的內(nèi)容包括 生活環(huán)境、飲食方式和習慣、心情和情緒、既往病史及惡性腫瘤家族史等五大方面）初步篩 查食管癌高危個體，然后針對高危個體再施行胃鏡下碘染色指示性活檢技術。但在實際執(zhí) 行中發(fā)現(xiàn)其具有較高的假陰性率（即漏診)，ROC曲線下面積AUC為0. 70 (95%CI，0. 66 -〇? 74)(文獻來源：ThriftAP,KendallBJ,PandeyaN,VaughanTL,WhitemanDC.A clinicalriskpredictionmodelforBarrettesophagus.CancerPrevRes(Phila), 2012, 5(9) : 1115-23.)。由于該傳統(tǒng)初篩方法效果不理想，目前食管癌篩查范圍僅作40-69 歲的年齡限定。
[0005] 代謝組學是對生物樣品（如血清、尿液、唾液等）中所有分子量低于lOOODa小分子 代謝物(如脂肪酸、氨基酸、核苷及留體等生物小分子）進行定性定量檢測，從而監(jiān)測機體受 疾病或危險因素累積等干擾后內(nèi)源性物質做出的代謝響應。體內(nèi)的生物信息由基因經(jīng)轉錄 傳遞給蛋白質，最終體現(xiàn)為小分子代謝物。不同于基因組學和蛋白組學反映的生物體內(nèi)在 差異，代謝組學的研究領域擴展到了機體與環(huán)境之間的相互影響和作用。小分子代謝物不 僅是機體生命活動、生化代謝的物質基礎，還體現(xiàn)了某些外來因素對體內(nèi)代謝環(huán)境的改變， 因而某些獨特代謝物的濃度在不同個體間的差異事實上反映了疾病內(nèi)在的表現(xiàn)和外在病 因。近年來研究發(fā)現(xiàn)，諸如代謝性疾病和惡性腫瘤(卵巢癌)等疾病發(fā)生發(fā)展過程中，機體基 礎生化代謝均發(fā)生了明顯變化，對人類理解復雜疾病的代謝機制將發(fā)揮重要作用，同時為 復雜疾病的篩檢和早期診斷提供嶄新的技術方法。
[0006] 食管癌是一種典型的代謝性疾病，在我國90%以上患者為食管鱗狀細胞癌 (ESCC)，其通常表現(xiàn)為機體整體的代謝紊亂，因此代謝組學技術和方法非常適合于食管癌 的研究。目前，已經(jīng)有人利用代謝組學對食管癌進行研究，例如Wu等（WuH，XueR，Lu C,etal.Metabolomicstudyfordiagnosticmodelofoesophagealcancerusing gaschromatography/massspectrometry.JChromatogrBAnalytTechno1Biomed LifeSci，2009,877(27):3111_7.)、Zhang等（ZhangJ，BowersJ，LiuL，etal. EsophagealcancermetabolitebiomarkersdetectedbyLC-MSandNMRmethods. PLoSOne, 2012, 7(1):e30181.)、Xu等（XuJ，ChenY，ZhangR，etal.Global andtargetedmetabolomicsofesophagealsquamouscellcarcinomadiscovers potentialdiagnosticandtherapeuticbiomarkers.MolCellProteomics, 2013, 12(5) : 1306-18.)都利用代謝組學技術對食管癌進行了研究，但總體來說這些研究 大多集中于病理學和發(fā)病機制的研究，為疾病的發(fā)生機理提供了新的線索，所使用的樣本 也是基于醫(yī)院采集的食管癌晚期患者的樣本，所得的研究結果僅能發(fā)現(xiàn)食管癌發(fā)病晚期同 健康對照相比的代謝輪廓差異，而癌癥晚期的血清代謝情況與癌前病變的血清代謝差異巨 大，并不能對于食管癌的早期篩檢和早期診斷帶來幫助。并且，目前上述研究方法在健康對 照選取上容易受到選擇性偏倚影響，造成評價結果的推廣性較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對現(xiàn)有技術中食管癌早期篩查方法繁瑣、費用高、對檢測人群造成痛苦等不足， 還沒有一種簡便快捷、適合大范圍的缺陷，本發(fā)明提供了一種血清代謝組學分析模型，該分 析模型構建方法簡單，能夠代替胃鏡下碘染色指示性活檢技術對人群進行食管癌早期、初 步篩查，既經(jīng)濟實惠、方便快捷，又能避免待檢測人群的痛苦，便于推廣應用。
[0008] 本發(fā)明針對目前采用胃鏡下碘染色指示性活檢技術對食管癌進行初步篩查的不 足，首次提出采用血清代謝組學技術代替胃鏡下碘染色指示性活檢技術對食管癌進行初步 篩查的思路。本發(fā)明依托"國家食管癌早診早治示范基地（山東省肥城市)"的食管癌篩檢 與隨訪人群隊列，針對項目中所有胃鏡下碘染色指示性活檢對象，采集初次發(fā)現(xiàn)的上消化 道病變、食管癌癌前病變和食管癌早期患者的血清標本，并隨機抽取篩檢中無上消化道病 變的健康對象作為對照組，使用快速分離液相色譜和質譜儀（LC/MS)的高通量檢測獲得相 應的代謝指紋圖譜，并通過對圖譜的進一步分析構建得到了模型，該模型能夠分析辨別血 清代謝物情況，通過血清代謝物情況能夠初步判斷是否具有食管癌患病危險。利用本發(fā)明 模型可以用于高發(fā)病區(qū)的全人群食管癌早期篩檢，篩除沒有患病危險的人群，然后再針對 高危個體進行常規(guī)內(nèi)鏡檢查，判斷是否患有食管癌。本發(fā)明縮小了內(nèi)鏡檢查的范圍，對于食 管癌篩檢的實施和推廣有著重要的經(jīng)濟和社會效益。
[0009] 本發(fā)明具體技術方案如下： 一種血清代謝組學分析模型，構建方法包括以下步驟： (1) 收集健康血清樣本和患病血清樣本，作為分析樣本； (2) 將每個分析樣本采用LC-MS血清代謝組學技術進行分析，得健康血清樣本和患病 血清樣本的原始代謝指紋圖譜； (3) 將健康血清樣本和患病血清樣本的原始代謝指紋圖譜進行圖譜預處理，得到每行 為分析樣本，