每列為代謝物信息的二維矩陣，用于進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析； (4) 將步驟（3)的二維矩陣依次進(jìn)行主成分分析（PCA)和偏最小二乘判別分析 (PLS-DA)，得PLS-DA模型，對(duì)得到的PLS-DA模型進(jìn)行驗(yàn)證，無(wú)過(guò)擬合危險(xiǎn)，則所得PLS-DA 模型即為血清代謝組學(xué)分析模型。
[0010] 上述構(gòu)建方法中，所述LC-MS血清代謝組學(xué)技術(shù)是采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng) 檢測(cè)血清的代謝指紋圖譜的方法，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所用的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 系統(tǒng)為超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（UPLC-QT0F/MS)。優(yōu)選的，液相色譜所用色 譜柱為WatersACQUITYUPLC?HSST3 (1.8iim; 100mm(length)X2.1mm)色譜 柱，進(jìn)樣量為6yL，進(jìn)樣溫度為4°C，流速為0. 5ml/min。色譜流動(dòng)相包含兩種溶劑：A為 0.lwt%甲酸水溶液(正離子ESI+)或0. 5mmol/L氟化銨水溶液（負(fù)離子ESI-)，B為0.lwt% 甲酸的乙腈溶液（正離子ESI+)或純乙腈(負(fù)離子ESI-)。色譜梯度洗脫條件為：〇-lmin為 1%B，l-8min為1%B-100%B逐漸遞增，然后10-10.lmin為100%B迅速減為1%B，然后1%B持 續(xù)1. 9min。優(yōu)選的，質(zhì)譜檢測(cè)使用四極桿時(shí)間飛行質(zhì)譜儀Q-T0F，并采用電噴霧離子源的正 離子模式（ESI+)和負(fù)離子模式（ESI-)。離子源溫度設(shè)定為400°C，錐孔氣流量為12L/min。 同時(shí)，脫溶劑氣溫設(shè)定為250°C，脫溶劑氣流量16L/min。在正離子和負(fù)離子模式下毛細(xì)管 電壓分別為+3kV和-3kV，錐孔電壓均為0V。錐孔壓力為20psi(正離子）和40psi(負(fù)離 子)。圖譜數(shù)據(jù)采集的質(zhì)荷比范圍為50~1200m/z，采集的掃描頻率為0. 25s。
[0011] 上述構(gòu)建方法中，所述患病血清樣本選自食管炎患者、輕度不典型增生患者、重度 不典型增生患者、中度不典型增生患者、食管癌癌前病變患者、食管癌早期患者和原位癌患 者的血清。所述患者血清樣本可以是患有上述一種病癥的患者的血清，也可以是患有上述 兩種或兩種以上的病癥的患者的血清(例如患病血清為食管炎患者血清和輕度不典型增生 患者的血清，或者是重度不典型增生患者血清、中度不典型增生患者血清和食管癌早期患 者血清)，優(yōu)選的，患病血清樣本含有患有上述每種病癥的患者的血清（即患病血清樣本中 同時(shí)含有食管炎、輕度不典型增生、重度不典型增生、中度不典型增生、食管癌癌前病變、食 管癌早期和原位癌患者的血清)，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度更高。
[0012] 上述構(gòu)建方法中，所述健康血清樣本為沒(méi)有患病血清樣本所對(duì)應(yīng)疾病或者與所對(duì) 應(yīng)疾病類似的疾病的人群的血清，也可以說(shuō)是健康血清樣本為沒(méi)有上消化道病變的人群的 血清。
[0013]上述構(gòu)建方法中，所得PLS-DA模型的R2X=0.231,R2Y=0.749,Q2cum=0.638。在 此情況下模型靈敏度高，特異性好，具有很好的外推效果。
[0014] 上述構(gòu)建方法中,所述健康血清樣本和患病血清樣本均來(lái)自40-69歲人群。
[0015] 上述構(gòu)建方法中，所選擇的血清樣本數(shù)量大，所述患病血清樣本453個(gè)，健康血清 樣本187個(gè)，預(yù)測(cè)效果更高。
[0016] 上述構(gòu)建方法中，為了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)模型構(gòu)建時(shí)的質(zhì)量控制情況，加入質(zhì)量控制樣品 進(jìn)行質(zhì)量控制。加入方式為：每10個(gè)分析樣本加入一個(gè)質(zhì)量控制樣品，該質(zhì)量控制樣品可 以用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分析樣本從進(jìn)樣前處理到分析過(guò)程中的質(zhì)量控制情況。所述質(zhì)量控制樣 品組成相同，均為同一健康血清樣本和同一患病血清樣本按照1:1的體積比混合得到的樣 品。
[0017] 上述構(gòu)建方法中，在取得分析樣本和質(zhì)量控制樣品后，要對(duì)他們進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處 理后再加入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)樣前的預(yù)處理包括以下步驟： (1) 用移液器抽取50y1分析樣本或質(zhì)量控制樣品，置于Bravo自動(dòng)標(biāo)本處理系統(tǒng) (Agilent,USA)的 96 孔板上； (2) 加入150 甲醇提取，渦旋30s，并在-20°C下孵化以沉淀蛋白。
[0018] (3)然后于高速離心機(jī)中在4°C下以4000轉(zhuǎn)/分離心20min; (4)將步驟（3)的上清液倒入LC-MS進(jìn)樣瓶中，保存在-80°C下以備LC-MS檢測(cè)。
[0019] 上述Bravo自動(dòng)標(biāo)本處理系統(tǒng)，也叫Bravo自動(dòng)化液體處理平臺(tái)。
[0020] 上述分析樣本和質(zhì)量控制樣品預(yù)處理過(guò)程中，如果分析樣本和質(zhì)量控制樣品取樣 時(shí)間較長(zhǎng)，可以將它們放入-80°c冰箱內(nèi)保存，預(yù)處理時(shí)將裝有已冷凍的0. 4ml分析樣本或 質(zhì)量控制樣品的〇. 5ml離心管置于水中，水平面以沒(méi)過(guò)冰凍表面為宜，放入冰箱冷藏室中 進(jìn)行解凍；完全解凍后，渦旋30s。經(jīng)過(guò)以上解凍處理后再用上述預(yù)處理步驟進(jìn)行預(yù)處理。
[0021] 上述構(gòu)建方法中，對(duì)原始代謝指紋圖譜進(jìn)行圖譜預(yù)處理是指：用Masshunter軟件 將獲得的原始代謝指紋圖譜轉(zhuǎn)換為MZdata數(shù)據(jù)文件，然后將Mzdata數(shù)據(jù)文件使用XCMS軟 件包進(jìn)行包括保留時(shí)間校正、峰識(shí)別、峰匹配和峰對(duì)齊的預(yù)處理操作，得到可用于統(tǒng)計(jì)分析 的二維矩陣，矩陣中的每行為分析樣本或質(zhì)量控制樣品，每列為代謝物信息。
[0022] 在上述血清代謝組學(xué)分析模型中，健康血清樣本和患病血清樣本的代謝物信息分 別位于模型的不同位置，且各自無(wú)重疊，可以記為健康血清樣本組區(qū)域?yàn)殛幮詤^(qū)域，患病血 清樣本組區(qū)域?yàn)殛?yáng)性區(qū)域。
[0023] 使用上述血清代謝組學(xué)分析模型，可以用于血清樣本的代謝組學(xué)分析。
[0024] 本發(fā)明的分析血清代謝組學(xué)的方法，包括以下步驟：將待檢血清樣本進(jìn)行預(yù)處理， 達(dá)到進(jìn)樣要求；將預(yù)處理的待檢血清樣本采用LC-MS血清代謝組學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析，得該待 檢血清樣本的原始代謝指紋圖譜；將該原始代謝指紋圖譜進(jìn)行圖譜預(yù)處理，得到可以用于 統(tǒng)計(jì)分析的代謝物信息；將該代謝物信息導(dǎo)入血清代謝組學(xué)分析模型中，用于分析待檢血 清樣本的代謝組學(xué)情況。通過(guò)分析可以獲得食管癌早期篩查風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)概率(大于50%即 為陽(yáng)性)，從而通過(guò)人體代謝情況判定食管癌篩查風(fēng)險(xiǎn)。在實(shí)際應(yīng)用中，如果待檢血清樣本 的代謝物信息位于模型的患病血清樣本組區(qū)域(即陽(yáng)性區(qū)域，即預(yù)測(cè)概率大于50%)，則表示 該人具有食管癌的患病危險(xiǎn)，需要進(jìn)行進(jìn)一步的內(nèi)鏡下指示性活檢；如果待檢血清樣本的 代謝物信息位于模型的健康血清樣本組區(qū)域(即陰性區(qū)域，預(yù)測(cè)概率小于50%)，則表示該人 不具有食管癌的患病危險(xiǎn)，不需要進(jìn)行進(jìn)一步的檢查。
[0025]上述分析血清代謝組學(xué)的方法中，對(duì)待檢血清樣本進(jìn)行預(yù)處理的步驟、將待檢血 清樣本的原始代謝指紋圖譜進(jìn)行圖譜預(yù)處理的步驟都和上述構(gòu)建血清代謝組學(xué)分析模型 時(shí)的預(yù)處理步驟、圖譜預(yù)處理步驟相同。
[0026]本發(fā)明依托"國(guó)家食管癌早診早治示范基地(肥城市)"篩檢平臺(tái)，采集食管炎、不 典型增生(又叫非典型增生、異型增生)、癌前病變及早期食管癌階段的血清標(biāo)本，所選血清 標(biāo)本高達(dá)640例，范圍廣，數(shù)量多，真實(shí)性更加可靠。通過(guò)UPLC-QT0F/MS和統(tǒng)計(jì)模式識(shí)別 方法獲得血清代謝物分析模型，該模型可以作為食管癌高發(fā)地區(qū)人群食管癌早期篩檢的模 型，達(dá)到對(duì)食管癌的早期篩查的目的。
[0027]本發(fā)明血清代謝組學(xué)分析模型和分析血清代謝組學(xué)的方法是基于食管癌早期或 者癌變前的血清樣本得到的，相比于基于醫(yī)院的食管癌中晚期患者的血清樣本得到的模 型，本發(fā)明血清代謝組學(xué)情況與要篩查的高危人群的血清代謝組學(xué)情況匹配度更高，更適 合食管癌的早期篩查。并且通過(guò)對(duì)建模方法的優(yōu)化，本發(fā)明模型靈敏度高，特異性好，能很 好的分辨健康人群和高?；疾∪巳?，非常適合臨床應(yīng)用。
[0028]本發(fā)明首次將血清代謝組學(xué)分析技術(shù)用于食管癌早期篩查中，通過(guò)本發(fā)明可以對(duì) 食管癌高發(fā)區(qū)的全人群進(jìn)行初步篩查，快速、便捷的篩選出食管癌高發(fā)人群，準(zhǔn)確度高，縮 小了食管癌篩查的范圍。本發(fā)明將食管癌篩查方法由傳統(tǒng)的直接胃鏡下碘染色指示性活檢 篩查方法變?yōu)橄冉?jīng)本發(fā)明分析血清代謝組學(xué)的方法篩查，篩查結(jié)果為陽(yáng)性的個(gè)體再行胃鏡 下碘染色指示性活檢技術(shù)進(jìn)行篩查，分析血清代謝組學(xué)時(shí)僅需采集血清，無(wú)創(chuàng)、花費(fèi)低，有 效提高了食管癌高發(fā)區(qū)全人群篩查的效率，大大降低了篩查成本，有效避免了部分人群有 創(chuàng)胃鏡造成的痛苦，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，便于推廣應(yīng)用。此外，本發(fā)明方法的提出 還有利于簡(jiǎn)便的發(fā)現(xiàn)食管癌疑似病患，有利于癌癥的早發(fā)現(xiàn)、早治療，具有很高的科研和醫(yī) 學(xué)價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1為血清代謝組學(xué)檢測(cè)的質(zhì)量控制圖，橫軸為保留時(shí)間，縱軸為代謝物在QC樣 本中的RSD%值。
[0030]圖2為代謝輪廓預(yù)分析的PCA得分圖，其中NEG為陰性，表示健康血清樣本，P0S為