例子包括，例如微量滴定板、珠、棒 或微珠?？贵w也可以被附著到如上所述的蛋白質(zhì)芯片（ProteinChip)陣列或探針基板。
[0218] 用于鑒定結(jié)合至感興趣的多肽的可檢測標記，包括但不限于：熒光色素 (fluorochrome)、熒光染料、放射性標記、酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶）以及其它本 領(lǐng)域常用的標記，以及比色標記包括膠體金或有色玻璃或塑料珠?？蛇x地，所述樣品中的標 記物可以采用間接測定進行檢測，其中例如標記的二抗被用于檢測結(jié)合標記物特異性的抗 體。
[0219] 用于檢測抗體-標記物復合物的存在或測量其量的方法包括，例如，檢測熒光、化 學發(fā)光、發(fā)冷光（luminescence)、吸光度、雙折射、透射率、反射率或折射率如表面等離子體 共振、生物傳感器、橢圓偏振、共振鏡法、光柵耦合器波導法或干涉法。射頻方法包括多極共 振譜。電化學方法包括安培和伏安法。光學方法包括成像方法和非成像方法和顯微鏡法。
[0220] 用于檢測抗體-標記物復合物的存在或測量其量的有用測定法包括，例如，酶聯(lián) 免疫吸附測定法（ELISA)、放射免疫測定法（RIA)或免疫印跡測定法。例如，這樣的方法 被描述于 Clinical Immunology (Stites&Terr, eds. ,7th ed. 1991)、Methods in Cell Biology :Antibodies in Cell Biology，volume 37 (Asai，ed. 1993)和同上的Harlow&Lane 中。
[0221] 在特定的實施方案中，本發(fā)明的方法可以利用本領(lǐng)域已知的一個或更多個抗 體。能夠結(jié)合IFI27多肽的抗體是本領(lǐng)域已知的，并且包括抗IFI27多克隆抗體，目 錄號：LS-C70809, LSBio ;IFI27 多克隆抗體（AOl)，目錄號：H00003429-A01，Abnova Corporation ;IFI27 多克隆抗體，目錄號：PAB8961，Abnova Corporation ;IFI27 抗體，目 錄號：H00003429-A01，Novus Biologicals ;FI27 抗體，目錄號：H00003429-D01P，Novus Biologicals ;IFI27 兔多克隆抗體（Sapphire Bioscience，USA)，IFI27MaxPab 兔多克隆抗 體。
[0222] 如本文中所指出的，通過免疫分析和相關(guān)方法研宄IFI27表達已經(jīng)在文獻中報 道，如由NzeusseuToukap et al (2007年；其內(nèi)容作為參考引入本文），并且應(yīng)當理解的 是，本發(fā)明的方法、試劑、裝置和試劑盒可以包含使用先前報道的用于IFI27研宄的抗體。 應(yīng)當理解的是，本發(fā)明以及因此本發(fā)明的所述方法、試劑、裝置和試劑盒包括根據(jù)本文描 述的任何合適的抗體，且不僅限于本文特別提到的那些抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員會知曉， 合適的抗體可以通過文獻檢索、常規(guī)測試進行鑒定，并可以被列于在線數(shù)據(jù)庫中，如WWW. antibodies-online. com〇
[0223] 用于檢測的方法和試劑盒
[0224] 如本文所使用的，確定干擾素α誘導蛋白27(IFI27)基因產(chǎn)物的水平，可以在各 種實施方案中包括確定樣品中基因產(chǎn)物的存在、不存在或其量，并且可以包括定量樣品中 基因產(chǎn)物的量。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法的所有步驟在受試者身體（如受試者 人體或動物身體）之外發(fā)生，使得所述方法沒有在所述身體上實施。因此，在優(yōu)選的實施方 案中，本發(fā)明并不涉及在人體或動物身體上實施的任何物理介入。
[0225] 確定IFI27基因產(chǎn)物的水平包括相對定量，如通過與另一個樣品或參考進行比較 來評估給定樣品中IFI27基因產(chǎn)物的存在，例如其中所測試的樣品被發(fā)現(xiàn)大于、小于或大 約等于參考中的基因產(chǎn)物的量。
[0226] 定量并且因此確定所述水平，還可以包括樣品或方法的標準化以考慮到特異性針 對所述樣品的測定中的差異。典型地，這包括確定樣品中可檢測的另一種組分的水平。例 如，當確定IFI27基因產(chǎn)物的水平包括確定IFI27的mRNA轉(zhuǎn)錄物的水平，樣品可以進行標 準化以考慮在實施本發(fā)明中樣品之間的差異。內(nèi)部參考標記物可以是樣品中任何合適的組 分，如基因產(chǎn)物，并將通常為這樣的組分，其在來自健康受試者和在不健康的受試者的樣品 中的存在是均勻的；或是這樣的組分，其在沒有感染流感的受試者和在感染流感的受試者 的樣品中的存在是均勻的。作為特異性的例子，甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH)的基因產(chǎn)物 被用作內(nèi)部參考。
[0227] 因此，本發(fā)明的方法包括將來自患者的生物樣品中IFI27基因產(chǎn)物的水平與表示 臨床風險的參考標準進行比較?？梢圆捎萌魏魏线m的參考標準。例如，所述參考標準可以 是來自健康受試者的樣品，或者可以是典型地發(fā)現(xiàn)于健康受試者中的IFI27基因產(chǎn)物的 量。在這種情況下，與所述標準相比在所述患者樣品中IFI27升高的水平表示在所述患者 中有臨床風險。作為進一步的例子，所述參考標準可以是來自感染了流感病毒的有癥狀受 試者的樣品，或者可以是在沒有發(fā)展成嚴重疾病的感染流感病毒的受試者中發(fā)現(xiàn)的典型的 IFI27基因產(chǎn)物的量；與所述標準相比在所述患者樣品中IFI27升高的水平表示在所述患 者中有臨床風險。
[0228] 所述參考標準可以表示有臨床風險，在這種情況下，與這樣的參考相比在患者樣 品中IFI27基因產(chǎn)物相等或升高的水平表示在受試者中有臨床風險。
[0229] 作為進一步的例子，所述參考標準可以是界定臨床風險的標準曲線。在這種情況 下，所述參考標準可以獨立于在所述患者樣品中IFI27基因產(chǎn)物水平的確定，例如所述參 考曲線可以是界定臨床風險的補充參考曲線的形式。
[0230] 所述參考標準可以在確定來自所述患者的生物樣品中的IFI27基因產(chǎn)物水平的 同時進行制備。例如，這可以包括通過將IFI27基因產(chǎn)物的一個或更多個已知樣品經(jīng)受與 用于確定在來自所述患者的生物樣品中IFI27基因產(chǎn)物水平的相同方法來制備所述標準， 其中所述IFI27基因產(chǎn)物的一個或更多個已知樣品具有表示有臨床風險、或沒有臨床風險 的預(yù)定量，或者具有針對沒有或具有可忽略不計的臨床風險的受試者的典型量的選定的倍 數(shù)升高，所述倍數(shù)如5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、100倍、200倍、300倍、500 倍或1000倍。
[0231] 如本發(fā)明的特定實施方案所示，并且特別是在所述例子中，其中進行IFI27基因 產(chǎn)物的定量檢測，與在健康或者無癥狀的個體中所看到的那些相比，在來自已經(jīng)發(fā)展成流 感感染的嚴重疾病的患者的樣品中所檢測到的IFI27基因產(chǎn)物中有至少大約40倍至60倍 的升高。通過與健康或者無癥狀的個體進行比較，在來自患有流感或病毒性肺炎的患者的 樣品中所檢測到的IFI27基因產(chǎn)物中有至少大約10倍的升高。
[0232] 確定IFI27基因產(chǎn)物的水平還可以包括絕對定量，如其中樣品中的IFI27基因產(chǎn) 物的量被確定，如被以合適的單位表達，例如可以被表達為倍數(shù)變化的量，樣品的單位/體 積，如每毫升、微升、納升等中所含有的克、微克、納克、皮克、飛克等。
[0233] 截斷值可以在本發(fā)明的各種實施方案中被實現(xiàn)。例如，在一個實施方案中，截斷值 可以通過定量測量樣品中IFI27基因產(chǎn)物的實際量（如以樣品的量/ml形式的測量）來實 現(xiàn)。在另一個實施方案中，截斷值可以通過在所期望的截斷值設(shè)定可檢測性下限或閾值來 實現(xiàn)。在這種形式下，由于提供樣品的受試者的流感感染，所述樣品中IFI27基因產(chǎn)物的檢 測（在該上下文中其可以稱為陽性信號）表示有嚴重疾病，而在樣品中沒有可檢測的IFI27 基因產(chǎn)物（在該上下文中其可以稱為陰性信號）表示提供所述樣品的受試者沒有患有流感 或者是無癥狀的。這樣的實施方案，在任何合適的正/負截斷值，可以發(fā)現(xiàn)在這樣的情況 下的特定用途，其中相對快速的診斷是期望的，或者其中相對復雜的測試設(shè)備（equipment) 并不總是可用的。例如，這可以是在護理點或在醫(yī)生的咨詢室。
[0234] 本文所公開的多核苷酸和多肽的檢測可以采用任何合適的方法進行。例如，用于 檢測IFI27基因產(chǎn)物（如多核苷酸和/或多肽）的方法可以涉及對IFI基因產(chǎn)物具有特異 性的引物、探針或抗體的使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在合適的技術(shù)和測定中利用引物、探針 或抗體，所述技術(shù)和測定包括例如聚合酶鏈式反應(yīng)（以及該技術(shù)的相關(guān)變化形式）、基于抗 體的測定（如ELISA和流式細胞術(shù)），以及熒光顯微術(shù)。通過其可以鑒定本文所公開的特 征多肽的方法通常是本領(lǐng)域已知的，并且被描述于例如Coligan J.E.et al. (Eds)Current Protocols in Protein Science (2007)，John Wiley and Sons，Inc、Walker，J. M.， (Ed)(1988)New Protein Techniques ：Methods in Molecular Biology, Humana Press， Clifton，N. J 和 Scopes，R. K. (1987)Protein Purification principles and Practice， 3rd. Ed.，Springer-Verlag，New York，N. Y 中。例如，由 IFI27 編碼的多肽可以通過 Western 印跡或光譜分析進行檢測。用于多肽檢測的合適方法的另外例子被描述于，例如美國專利 第4683195號、美國專利第6228578號、美國專利第7282355號、美國專利第7348147號和 PCT 公開 W0/2007/056723 中。
[0235] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，IFI27基因產(chǎn)物的檢測和確定是通過如下來實現(xiàn)的， 即采用與IFI27基因產(chǎn)物的序列或其變體或片段特異性雜交的引物，通過聚合酶鏈式反應(yīng) 擴增來自感興趣的樣品的核苷酸序列，并檢測所擴增的序列。在這種情況下，典型的靶序列 是IFI27 mRNA，如具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的序列；或IFI27的cDNA序列， 如具有SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6所示的序列，或其任何片段或變體。在本發(fā)明的實施 方案中，可以采用多個靶序列、其片段或變體。
[0236] 所述方法可包括檢測多個序列、其片段或變體。所述方法還進一步包括納入控制， 如用于正確或一致性執(zhí)行所述方法，或允許將mRNA的表達水平在樣品之間進行標準化。例 如，所述方法可以包括檢測一種或更多種多核苷酸或多肽或其片段或變體，已知組成型表 達的，如GAPDH，或者已知在感染流感的受試者和沒有感染流感的受試者中以一致的水平表 達的。
[0237] 采用本發(fā)明所述方法和試劑盒將核酸提取和純化至必須或者期望的程度以用 于分析的合適方法通常是本領(lǐng)域已知的，并被描述于例如，Ausubel F.M.et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology(2007), John Wiley and Sons，Inc、Molecular Cloning :A Laboratory Manual，4th ed.，Green and Sambrook，2012 中。本領(lǐng)域技術(shù)人員 將容易理解的是，本發(fā)明并不限于本文所述的用于核酸分離的特定方法，其它合適的方法 也被本發(fā)明涵蓋。在核酸分析之前，本發(fā)明可以無需核酸分離而進行。
[0238] 為本發(fā)明的目的將多肽提取和純化至必須或者期望的程度的合適方法通常 是本領(lǐng)域已知的，并被描述于例如，Coligan J.E.et al. (Eds)Current Protocols in Protein Science(2007)，John Wiley and Sons，Inc、Walker，J.M·，（Ed) (1988)New Protein Techniques ：Methods in Molecular Biology, Humana Press, Clifton, N. J 和 Scopes，R. K. (1987)Protein Purification principles and Practice,3rd. Ed., Springer-Verlag，New York，N. Y中。適合用于蛋白提取的技術(shù)的例子包括但不限于，透析、 超濾和沉淀。蛋白質(zhì)純化技術(shù)適合用于包括但不限于，反相層析、疏水相互作用層析、離心、 凝膠過濾、硫酸銨沉淀和離子交換。
[0239] 根據(jù)本發(fā)明的方法和試劑盒，可以通過任何本領(lǐng)域已知的合適手段檢測多核苷酸 或其變體或片段。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，通過PCR擴增檢測所述多核苷酸。在PCR 方法中，寡核苷酸引物可以被設(shè)計用于PCR反應(yīng)，以擴增代表1FI27基因產(chǎn)物的多核苷酸。 典型地，所述PCR包括通過相關(guān)序列的反轉(zhuǎn)錄來定量擴增從信使RNA(mRNA)制備的互補 DNA(cDNA) (RT-PCR)。PCR的已知方法包括但不限于：采用成對引物、嵌套引物、單特異性引 物、簡并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯配引物等的方法。用于設(shè)計PCR和 RT-PCR引物的方法通常是本領(lǐng)域已知的，并且被公開于例如，Ausubel F.M.et al. (Eds) Current Protocols in Molecular Biology(2007), John Wiley and Sons，Inc、Maniatis et al. Molecular Cloning (1982), 280-28K Innis et al. (Eds) (1990) PCR Protocols ：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)、Innis and Gelfand， (Eds)(1995)PCR Strategies(Academic Press， New York)、 Innis and Gelfand, (Eds) (1999)PCR Methods Manual(Academic Press， New York)和 Sambrooket al. (1989) Molecular Cloning ：A Laboratory Manual(2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York、Molecular Cloning ：A Laboratory Manual, 4th ed.，Green and Sambrook，2012 中。
[0240] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當容易理解的是，進行PCR和RT-PCR程序的各種參數(shù)可在不 影響獲得所期望的產(chǎn)物的能力情況下被改變。例如，可以改變鹽濃度或可以改變變性、退火 和延伸步驟中一個或更多個的時間和/或溫度。類似地，還可以基于可用核酸的量或有效 擴增所需要的最佳模板量改變DNA、cDNA或RNA模板的量。用于本發(fā)明的所述方法和試劑 盒的引物典型地為寡核苷酸，通常長度至少大約5個核苷酸到大約80個核苷酸，更典型地 長度大約10、11、12、13或14個核苷酸到長度大約50個核苷酸，并且甚至更典型地長度大 約15個核苷酸到長大約30個核苷酸，如長15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29或30個核苷酸中的任意一個。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到，本文所述的引物可以用 于若干不同的應(yīng)用，包括但不限于PCR、RT-PCR，并且采用探針用于檢測本文所鑒定的序列 作為高度侵入性株的特征。
[0241] 這樣的引物可以通過任何合適的方法制備，包括例如直接化學合成或合適的序列 的克隆和限制性酶切。不是在引物中所有堿基都需要反映引物所要雜交的模板分子的序 列，所述引物只需要含有足夠的使得所述引物能與所述模板雜交的互補堿基。所述引物還 可以在一個或更多個位置包括錯配堿基，其作為不與模板堿基互補的堿基，而是被設(shè)計為 在堿基延伸或擴增時將變化引入所述DNA。引物可以包括另外的堿基，例如以在5'端的限 制性內(nèi)切酶識別序列的形式，以便于克隆所擴增的DNA。
[0242] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到，能夠擴增代表1FI27 mRNA序列或其片段的序列的任 何引物均適用于本發(fā)明的方法。IFI27 mRNA序列如SEQ ID NO :1和2中所示?？梢圆捎萌?何適于擴增包括SEQ ID NO :1和2或其片段或變體的核酸的寡核苷酸引物對。本領(lǐng)域的技 術(shù)人員將知曉的是，可以通過檢測代表1FI27 mRNA轉(zhuǎn)錄物的序列的常規(guī)方法（如通過PCR 擴增）來選擇合適的引物和引物對。
[0243] 作為特異性的例子，所述PCR擴增可以利用選自以下的引物對：⑴ ACCTCATCAGCAGTGACCAGT(正向引物；SEQ ID NO :7)和ACATCATCTTGGCTGCTATGG(反向引物； SEQ ID NO :8) ;(ii)TGC CTC GGG CAG CCT(正向引物；SEQ ID NO :9)和 TTG GTC AAT CCG GAG AGT CC(反向引物；SEQ ID N0:10) ;(iii)cag gaa ttc atA TGG AGG CCT CTG CTC TCA(ISG12f;SEQ ID N0:16)和 cgc gaa ttc agC TAG TAG AAC CTC GCAATG(ISG12r;SEQ ID NO :17)。
[0244] 還包括于本發(fā)明的保護范圍內(nèi)的是，例舉的寡核苷酸引物的變體和片段。本領(lǐng)域 技術(shù)人員還將認識到，本發(fā)明并不局限于使用例舉的特異性引物，還可以使用替代的引物 序列，只要所述引物被適當設(shè)計以便能夠擴增感興趣的特征序列。合適的引物序列可以由 本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)方法而無需過多的實驗來確定。用于對所期望的序列進行擴增 的合適引物的位置，可通過這樣的因素如G+C含量以及形成不希望的二級結(jié)構(gòu)的能力來確 定。
[0245] 分析所擴增的核酸的合適方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且被描述于例如 Sambrooket al. (1989)Molecular Cloning ：A Laboratory Manual(2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)、Ausubel F. M. et al. (Eds)Current Protocols in Molecular Biology (2007)，John Wiley and Sons，Inc 和 Maniatis et al. Molecular Cloning(1982)，280-281中。分析所擴增的核酸的合適方法包括，例如其之 前可以進行或不進行限制性酶切的凝膠電泳和/或核酸測序。凝膠電泳可以包括瓊脂糖凝 膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳，其為本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的基于大小分離DNA片段的 技術(shù)。凝膠中瓊脂糖或聚丙烯酰胺的濃度很大程度上確定了凝膠的分辨力，并且瓊脂糖或 聚丙烯酰胺合適的濃度將因此取決于要被區(qū)分的DNA片段大小。
[0246] 在本發(fā)明的其它實施方案中，可以通過使用合適的探針檢測IFI27基因產(chǎn)物（其 是多核苷酸及其變體或片段）。探針可以是能夠與IFI27基因產(chǎn)物如mRNA或其擴增的衍生 物選擇性地雜交的任何合適探針。探針是長度可變的核苷酸序列，例如在大約10個核苷酸 到幾千個核苷酸之間，用于典型地通過雜交來檢查同源序列。對于檢測代表1FImRNA轉(zhuǎn)錄 物的序列，探針可以典型地具有小于或者等于所述轉(zhuǎn)錄物長度的大小。本發(fā)明的雜交探針 可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸。
[0247] 用于設(shè)計和/或產(chǎn)生核苷酸探針的方法通常是本領(lǐng)域已知的，并且被描述于例 如，Robinson P.J..et al. (Eds)Current Protocols in Cytometry(2007)，John Wiley and Sons，Inc、Ausubel F. M. et al. (Eds)Current Protocols in Molecular Biology (2007)， John Wiley and Sons，Inc、Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning ：A Laboratory Manual(2nd ed. ， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York 和 Maniatis et al. Molecular Cloning(1982)，280_281 中。核苷酸探針的制備，可以通過例 如化學合成技術(shù)，例如，磷酸二酯和磷酸三酯的方法（參見例如Narang S.A.et al. (1979) Meth. Enzymol. 68 :90 ;Brown，Ε· L. (1979) et al. Meth. Enzymol. 68 :109 和美國專利第 4356270 號），二乙基亞磷酰胺醋法（參見 Beaucage S. L et al. (1981)Tetrahedron Letters，22 :1859-1862)。用于在改性的固相支持物上合成寡核苷酸的方法被描述于美國 專利第4458066號。
[0248] 本發(fā)明的探針或用于本發(fā)明的方法和試劑盒的探針，可以通過引入標記物進行 標記以方便它們的檢測。用于標記和檢測核酸的技術(shù)被描述于例如，Ausubel F.M.et al. (Eds)Current Protocols in Molecular Biology(2007), John Wiley and Sons, Inc. 中。合適的標記物的例子，包括熒光分子（例如，乙酰氨基芴、5-溴脫氧尿苷、地高辛、熒光 素）和放射性同位素（例如，32P、35S、3H、33P)。所述標記物的檢測可以通過例如化學、光 化學、免疫化學、生物化學或光譜的技術(shù)來實現(xiàn)。
[0249] 本發(fā)明的方法和試劑盒還涵蓋抗體的使用，所述抗體能夠特異性結(jié)合本發(fā)明的多 肽。所述抗體可以被用于定性或定量檢測和分析給定樣品中的一種或更多種多肽。用于抗 體的產(chǎn)生和使用的方法通常是本領(lǐng)域已知的，并且被描述于例如，Harlow and Lane(Eds) Antibodies-A Laboratory Manual，（1988)，Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y ： CoIigan，Current Protocols in Immunology(1991)、Goding，Monoclonal Antibodies ： Principles and Practice(1986)2nd ed和Kohler&Milste