一種結(jié)核分枝桿菌esat-6蛋白檢測試劑盒、制備方法以及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)核分枝桿菌ESAT-6蛋白檢測試劑盒、制備 方法以及使用方法。 技術(shù)背景
[0002] 本發(fā)明建立了一種檢測結(jié)核分枝桿菌相關(guān)抗原ESAT-6的納米磁珠-近紅外熒光 標記-檢測試劑盒。包括單克隆抗體的近紅外熒光染料標記方法和納米磁珠的多克隆抗體 包被方法以及系列相關(guān)試劑。本發(fā)明以近紅外熒光染料作為標記，采用免疫分析原理，制 備檢測ESAT-6雙抗體夾心法近紅外熒光試劑盒。采用便攜式流動進樣熒光檢測器進行磁 珠-結(jié)合物熒光強度測定。定量檢測時，將樣本檢測值代入標準方程，即可分析檢測樣本中 靶蛋白的濃度；定性檢測則以陰性對照的熒光強度的2倍作為反應(yīng)體系的cutoff值，大于 2倍cutoff值為陽性，反之則為陰性。該試劑盒適用于病理樣本中結(jié)核分枝桿菌相關(guān)蛋白 的檢測。本發(fā)明具有快速、高敏、兼顧定性及精準定量的特點。
[0003] 結(jié)核病是一種古老的傳染性疾病，目前全世界有1/3的人口受結(jié)核分枝桿菌的感 染，每年有近800萬人死于肺結(jié)核；耐藥性和多重耐藥性菌株的大量出現(xiàn)，又為結(jié)核病的控 制帶來更大的困難；更多的研宄還證實結(jié)核分枝桿菌能增強HIV-I病毒的復(fù)制，因此在艾 滋病感染者中，雙重感染者眾多，成為導(dǎo)致AIDS患者死亡的主要原因。我國目前的TB患者 數(shù)量居世界第二位，是世界上22個TB高負擔國家之一，2000年我國第4次TB流行病學抽 樣調(diào)查資料顯示，我國MTB感染率為44. 5%，活動性TB患者451萬，每年死亡人數(shù)達13 萬。
[0004]目前對于結(jié)核分枝桿菌的檢驗手段主要有涂片鏡檢法，該方法需要檢測人員具 有熟練的檢驗技能，方法檢測靈敏度低，一般需標本中存在l*l〇3CFU/ml個細菌才有10~ 15%的陽性率，并且對細菌無法進行準確的鑒定；培養(yǎng)法，主要在傳染病醫(yī)院進行該項工 作，檢測周期較長，一般需要6周時間才能發(fā)報告，晚近出現(xiàn)的全自動微生物鑒定儀雖然大 大縮短了檢驗周期，通常需要2周左右時間，這仍未根本解決效率的問題，并且存在著成本 高昂的缺陷，單純的試劑成本在120元/測試，且需要大型的設(shè)備；血清學檢驗方法主要 集中在對結(jié)核分枝桿菌相關(guān)抗體的檢測，由于結(jié)核感染患者存在免疫力低下的問題，往往 不表達相關(guān)抗體，或者由于成人感染結(jié)核菌幾率多，由于免疫記憶，許多曾感染者也可檢測 出相關(guān)抗體，這就為判斷造成麻煩；分子生物學的手段近來廣范運用于臨床檢測，諸如PCR 法、探針檢測法等，這些方法特異性好，但需要特殊的檢測儀器，推廣運用存在問題，超高的 靈敏度也帶來了難以克服的問題-假陽性；結(jié)核感染T細胞斑點試驗用于檢測結(jié)核感染 后特異性T細胞分泌的γ -干擾素，并據(jù)此結(jié)果判斷是否感染了結(jié)核，該方法特點是繁瑣， 成本高，不宜推廣，目前主要在西方國家作篩查使用；結(jié)核分枝桿菌特異性噬菌體擴增試驗 也曾在結(jié)核病實驗室發(fā)揮過作用，也存在繁瑣、成本高，在結(jié)果判斷中需要足夠的經(jīng)驗的缺 點。該方法的假陽性率為3 %~7 %，假陰性率為15 %~40 %。與培養(yǎng)的陽性符合率為 75%~95%，特異性為88%~99%。
[0005] 本發(fā)明將納米磁珠法與近紅外熒光標記法結(jié)合起來，利用納米磁珠表面羧基活化 后可與抗體表面的氨基共價結(jié)合，從而將抗體固定到納米磁珠表面，發(fā)揮了納米磁珠比表 面積大，吸附性強，懸浮穩(wěn)定性好，有利于抗原抗體反應(yīng)順利進行的特點；同時近紅外熒光 染料具有靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點，它的激發(fā)光以及發(fā)射光光譜均在近紅外區(qū)域，可最大 限度減少環(huán)境中雜散熒光物質(zhì)的干擾等優(yōu)點。建立起結(jié)核分枝桿菌相關(guān)抗原ESAT-6的近 紅外熒光標記-納米磁珠檢測方法，ESAT-6檢測限量達0. 5ng/ml水平。
[0006] 試劑盒組成20人份
[0007] 1、A液近紅外熒光染料標記ESA-6單克隆抗體Iml
[0008] 2、B液ESAT-6多克隆抗體包被磁珠 Iml
[0009] 3、PBS 緩沖液 IOml
[0010] 4、ESAT-6 標準品（1000ng/ml) 0.2ml

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 為了克服上述缺陷，提供以下技術(shù)方案：
[0012] 一種基于納米免疫磁珠-近紅外熒光標記法的結(jié)核分枝桿菌ESAT-6蛋白檢測 試劑盒，所述試劑盒由近紅外焚光染料標記的單克隆抗體、多克隆抗體包被的納米磁珠、 磁性分離器、蛋白標準品、緩沖液組成；其中，近紅外熒光染料標記的單克隆抗體為鼠抗 ESAT-6 ;包被納米磁珠的多克隆抗體為鼠多抗ESAT-6。建立ESAT-6蛋白標準品梯度濃度 和熒光發(fā)射值之間的工作曲線，將所測得的發(fā)射熒光強度，代入方程即可完成樣品中目標 蛋白含量的定量（定性）檢測。
[0013] 優(yōu)選地，所述近紅外熒光染料為激發(fā)光波長為777nm，發(fā)射光波長為790nm的熒光 分子，優(yōu)選NHS活化的近紅外熒光染料DyLight800。
[0014] 所述的一種基于納米免疫磁珠-近紅外熒光標記法的結(jié)核分枝桿菌ESAT-6蛋白 檢測試劑盒的制備方法，步驟如下：
[0015] (1)制備近紅外熒光染料標記的ESAT-6單克隆抗體；
[0016] 將 Dylight800 (購自 Thermofisher 公司）用 PBS 緩沖液（PH7. 4)稀釋 10 倍，取 1. 4 μ L與20 μ g鼠抗ESAT-6單克隆抗體（lmg/ml) (Pierece公司）輕柔混合均勾后于室溫 避光反應(yīng)2小時；反應(yīng)結(jié)束后，將標記產(chǎn)物放入透析袋中，4°C，PBS緩沖液透析4小時。標 記好的抗體溶液中添加終濃度為I. 5% BSA和0. 1% TWeen20,疊氮化鈉0. 1%。，4°〇保存； 使用前將標記產(chǎn)物以PBS稀釋2500倍；
[0017] (2)制備ESAT-6多克隆抗體包被的納米磁珠（購自武漢哇哇噻納技術(shù)開發(fā)有限公 司北京生物技術(shù)研宄所）；
[0018] 納米磁珠的預(yù)處理；
[0019] 輕輕混勾磁珠懸浮液，吸取0.0 lml懸浮液（25mg/ml)加入I. 5ml EP試管中；再加 入0.1 ml重蒸水，輕輕混勻并將試管架置磁板上，靜置2分鐘后吸取上清液；重復(fù)上述步驟 1次；
[0020] 加入1ml 0· IM的乙磺酸溶液（pH = 5. 0, MES)，重懸磁珠；
[0021] 納米磁珠的活化
[0022] 將上述EP管置于磁板上，用ImlMES洗滌2次，棄上清；
[0023] 臨用前配置終濃度為0.1 M的MES，其內(nèi)含EDC和NHS的濃度均為40g/L(加入上述 兩種物質(zhì)后，置于振蕩器上充分混勻15分鐘，待用）。用該液重懸磁珠；
[0024] 用磁板吸附磁珠，棄上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，棄上清；
[0025] (3)磁珠與蛋白的鏈接；
[0026] 在已處理好的磁珠中加入50 μ L ESAT-6多克隆抗體（lmg/ml) (Pierece公司售） 和500 μ L PBS (PH5. 5)，混勻，室溫，置于搖床上持續(xù)震蕩，孵育2小時；
[0027] 用PBS緩沖液（ΡΗ5. 5, (λ 05 % Tween)清洗3次，棄上清；
[0028] 加入1ml Tris緩沖液（0. 1M，0. 1 % BSA)，混勻，室溫，置于搖床上持續(xù)震蕩，孵育 2小時；
[0029] 加入1ml PBS緩沖液（PH5. 5,0· 05% Tween)，靜置2分鐘，棄上清；重復(fù)3次，加入 Iml PBS緩沖液（PH5. 5)，棄上清，重復(fù)3次。棄上清時，試管需置于磁板上；
[0030] 加入 Iml PBS 緩沖液（pH = 7. 4,0· 05% Tween-20,0. 1% BSA，0. 05NaN3)，待用；
[0031 ] (4)制備ESAT-6系列標準品；
[0032] ESAT-6(全片段重組蛋白，lmg/ml)(購自杭州啟泰生物公司），PBS(PH7. 4)緩沖液 稀釋至 l、5、50、250、1000ng/ml。
[0033] 一種使用所述的基于納米免疫磁珠-近紅外熒光標記法的結(jié)核分枝桿菌ESAT-6 蛋白檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于包括如下步驟：
[0034] (1)各取50 μ L各濃度的ESAT-6于EP管中，另取1支EP管加入50 μ LPBS (PH7. 4) 緩沖液作為陰性對照；
[0035] (2)以上各管加入熒光標記的ESAT-6單抗50 μ L，37°C反應(yīng)30分鐘；
[0036] (3)取完成預(yù)處理納米免疫磁珠100 μ L，用PBS緩沖液（PH7. 4)稀釋至1000 μ L ; 吸取50 μ L免疫磁珠，，加入所述試管中，37 °C反應(yīng)15分鐘，磁板上靜置2分鐘，棄上清；加 入500 μ LddH2O,磁板上靜置2分鐘，棄上清，重復(fù)該步驟3次；
[0037] 所述預(yù)處理納米免疫磁珠的處理方法為：
[0038] 制備ESAT-6多克隆抗體包被的納米磁珠（購自武漢哇哇噻納技術(shù)開發(fā)有限公司 北京生物技術(shù)研宄所）；
[0039] 1)納米磁珠的預(yù)處理：
[0040] 輕輕混勾磁珠懸浮液，吸取0.0 lml懸浮液（25mg/ml)加入I. 5ml EP試管中；再加 入0.1 ml重蒸水，輕輕混勻并將試管架置磁板上，靜置2分鐘后吸取上清液；重復(fù)上述步驟 1次；
[0041] 加入1ml 0· IM的乙磺酸溶液（pH