置于搖床上持續(xù)震蕩，孵育 2小時(shí)；
[0101] 加入1ml PBS緩沖液（PH5. 5,0.05% Tween)，靜置2分鐘，棄上清；重復(fù)3次，加入 Iml PBS緩沖液（PH5. 5)，棄上清，重復(fù)3次。棄上清時(shí)，試管需置于磁板上；
[0102] 加入 Iml PBS 緩沖液（pH = 7. 4,0· 05% Tween-20,0. 1% BSA，0. 05NaN3)，待用；
[0103] (4)各管加入100 y L PBS緩沖液（PH7. 4)，混勾，用便攜式熒光檢測(cè)器進(jìn)行熒光強(qiáng) 度測(cè)定（該設(shè)備固化為激發(fā)光波長(zhǎng)為777nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為790nm);
[0104] (5)結(jié)果判斷
[0105] 定性檢測(cè)以陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度值的2倍作為Cutoff值；
[0106] 定量檢測(cè)以熒光發(fā)射強(qiáng)度和對(duì)應(yīng)的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度進(jìn)行回歸分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲 線，并擬合方程。
[0107] 具體實(shí)例為：檢測(cè)胸水中的ESAT-6蛋白
[0108] 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至說明書中規(guī)定的各濃度，分別取50 μ L標(biāo)準(zhǔn)品、空白對(duì)照和處理后 的胸水，加入A液50 μ L，37°C反應(yīng)30分鐘；
[0109] 加入B液50yL，37°C反應(yīng)15分鐘。加入500 yL重蒸水，磁力架上靜置2分鐘，棄 上清，重復(fù)該步驟3次。
[0110] 各管加入100 μ L PBS緩沖液（PH7. 4)，用便攜式流動(dòng)進(jìn)樣熒光檢測(cè)器進(jìn)行熒光強(qiáng) 度測(cè)定。
[0111] 結(jié)果判斷
[0112] 定性檢測(cè)以陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度值的2倍作為Cutoff值；
[0113] 定量檢測(cè)以熒光發(fā)射強(qiáng)度和對(duì)應(yīng)的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度進(jìn)行回歸分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲 線，并擬合方程。
[0114] 表1 :不同濃度ESAT-6標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)檢測(cè)結(jié)果
[0115]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于納米免疫磁珠-近紅外熒光標(biāo)記法的結(jié)核分枝桿菌ESAT-6蛋白檢測(cè)試劑 盒，其特征在于：所述試劑盒由近紅外熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體、多克隆抗體包被的納米 磁珠、磁性分離器、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、緩沖液組成；其中，近紅外熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體為鼠 抗ESAT-6 ;包被納米磁珠的多克隆抗體為鼠多抗ESAT-6。建立ESAT-6蛋白標(biāo)準(zhǔn)品梯度濃 度和熒光發(fā)射值之間的工作曲線，將所測(cè)得的發(fā)射熒光強(qiáng)度，代入方程即可完成樣品中目 標(biāo)蛋白含量的定量（定性）檢測(cè)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于納米免疫磁珠-近紅外熒光標(biāo)記法的結(jié)核分枝桿菌 ESAT-6蛋白檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述近紅外熒光染料為激發(fā)光波長(zhǎng)為777nm，發(fā)射光 波長(zhǎng)為790nm的熒光分子，優(yōu)選NHS活化的近紅外熒光染料DyLight800。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于納米免疫磁珠-近紅外熒光標(biāo)記法的結(jié)核分枝桿菌 ESAT-6蛋白檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于步驟如下： (1) 制備近紅外熒光染料標(biāo)記的ESAT-6單克隆抗體； 將 Dylight800(購(gòu)自 Thermofisher 公司）用PBS 緩沖液（PH7.4)稀釋 10 倍，取1.4yL 與20 y g鼠抗ESAT-6單克隆抗體（購(gòu)自Pierece公司）lmg/ml輕柔混合均勾后于室溫避 光反應(yīng)2小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將標(biāo)記產(chǎn)物放入透析袋中，4°C，PBS緩沖液透析4小時(shí)。標(biāo)記 好的抗體溶液中添加終濃度為I. 5% BSA和0. 1% TWeen20,疊氮化鈉0. 154,4°C保存；使 用前將標(biāo)記產(chǎn)物以PBS稀釋2500倍； (2) 制備ESAT-6多克隆抗體包被的納米磁珠（購(gòu)自武漢哇哇噻納技術(shù)開發(fā)有限公司北 京生物技術(shù)研宄所）； 1) 納米磁珠的預(yù)處理： 輕輕混勾磁珠懸浮液，吸取0.0 lml懸浮液（25mg/ml)加入I. 5ml EP試管中；再加入 0.1 ml重蒸水，輕輕混勻并將試管架置磁板上，靜置2分鐘后吸取上清液；重復(fù)上述步驟1 次； 加入1ml 0.1 M的乙磺酸溶液（pH = 5. 0, MES)，重懸磁珠； 2) 納米磁珠的活化 將上述EP管置于磁板上，用ImlMES洗滌2次，棄上清； 臨用前配置終濃度為〇. IM的MES，其內(nèi)含EDC和NHS的濃度均為40g/L (加入上述兩種 物質(zhì)后，置于振蕩器上充分混勻15分鐘，待用）。用該液重懸磁珠； 用磁板吸附磁珠，棄上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，棄上清； 3) 磁珠與蛋白的鏈接； 在已處理好的磁珠中加入50 y L ESAT-6多克隆抗體（lmg/ml)(購(gòu)自Pierece公司） 和500 y L PBS (PH5. 5)，混勻，室溫，置于搖床上持續(xù)震蕩，孵育2小時(shí)； 用PBS緩沖液（PH5. 5,0? 05% Tween)清洗3次，棄上清； 加入1ml Tris緩沖液（0. 1M，0. 1 % BSA)，混勻，室溫，置于搖床上持續(xù)震蕩，孵育2小 時(shí)； 加入1ml PBS緩沖液（PH5. 5,0. 05% Tween)，靜置2分鐘，棄上清；重復(fù)3次，加入1ml PBS緩沖液（PH5. 5)，棄上清，重復(fù)3次。棄上清時(shí)，試管需置于磁板上； 加入 Iml PBS 緩沖液（pH = 7. 4,0. 05% Tween-20,0. 1% BSA，0. 05NaN3)，待用； (4)制備ESAT-6系列標(biāo)準(zhǔn)品； ESAT-6(全片段重組蛋白，lmg/ml)(購(gòu)自杭州啟泰生物公司），PBS(PH7. 4)緩沖液稀釋 至 l、5、50、250、1000ng/ml。
4. 一種使用權(quán)利要求1所述的基于納米免疫磁珠-近紅外熒光標(biāo)記法的結(jié)核分枝桿菌 ESAT-6蛋白檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 各取50 y L各濃度的ESAT-6標(biāo)準(zhǔn)品于EP管中，另取1支EP管加入 50 y LPBS (PH7. 4)緩沖液作為陰性對(duì)照； (2) 以上各管加入熒光標(biāo)記的ESAT-6單抗50 y L，37°C反應(yīng)30分鐘； (3) 取完成預(yù)處理納米免疫磁珠IOOy L，用PBS緩沖液（PH7. 4)稀釋至1000 yL;吸 取50 y L免疫磁珠，加入所述試管中，37°C反應(yīng)15分鐘，磁板上靜置2分鐘，棄上清；加入 500 y LddH2O,磁板上靜置2分鐘，棄上清，重復(fù)該步驟3次； 所述預(yù)處理納米免疫磁珠的處理方法為： 制備ESAT-6多克隆抗體包被的納米磁珠（購(gòu)自武漢哇哇噻納技術(shù)開發(fā)有限公司北京 生物技術(shù)研宄所）： 1) 納米磁珠的預(yù)處理： 輕輕混勾磁珠懸浮液，吸取0.0 lml懸浮液（25mg/ml)加入I. 5ml EP試管中；再加入 0.1 ml重蒸水，輕輕混勻并將試管架置磁板上，靜置2分鐘后吸取上清液；重復(fù)上述步驟1 次； 加入1ml 0.1 M的乙磺酸溶液（pH = 5. 0, MES)，重懸磁珠； 2) 納米磁珠的活化 將上述EP管置于磁板上，用ImlMES洗滌2次，棄上清； 臨用前配置終濃度為〇. IM的MES，其內(nèi)含EDC和NHS的濃度均為40g/L (加入上述兩種 物質(zhì)后，置于振蕩器上充分混勻15分鐘，待用）。用該液重懸磁珠； 用磁板吸附磁珠，棄上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，棄上清； 3) 磁珠與蛋白的鏈接； 在已處理好的磁珠中加入50 y L ESAT-6多克隆抗體（lmg/ml) (Pierece公司）和 500 y L PBS (PH5. 5)，混勻，室溫，置于搖床上持續(xù)震蕩，孵育2小時(shí)； 用PBS緩沖液（PH5. 5,0? 05% Tween)清洗3次，棄上清； 加入1ml Tris緩沖液（0. 1M，0. 1 % BSA)，混勻，室溫，置于搖床上持續(xù)震蕩，孵育2小 時(shí)； 加入1ml PBS緩沖液（PH5. 5,0. 05% Tween)，靜置2分鐘，棄上清；重復(fù)3次，加入1ml PBS緩沖液（PH5. 5)，棄上清，重復(fù)3次。棄上清時(shí)，試管需置于磁板上； 加入 Iml PBS 緩沖液（pH = 7. 4,0. 05% Tween-20,0. 1% BSA，0. 05NaN3)，待用； (4) 各管加入100 U L PBS緩沖液（PH7. 4)，混勾，用便攜式流動(dòng)進(jìn)樣熒光檢測(cè)器（為中 科院理論物理所制備的樣機(jī)，該設(shè)備固化為激發(fā)光波長(zhǎng)為777nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為790nm)進(jìn) 行熒光強(qiáng)度測(cè)定； (5) 結(jié)果判斷 定性檢測(cè)以陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度值的2倍作為Cutoff值； 定量檢測(cè)以熒光發(fā)射強(qiáng)度和對(duì)應(yīng)的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度進(jìn)行回歸分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并 擬合方程。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于納米免疫磁珠-近紅外熒光標(biāo)記法的結(jié)核分枝桿菌ESAT-6蛋白檢測(cè)試劑盒。本試劑盒中，以近紅外熒光染料標(biāo)記靶向于ESAT-6的單克隆抗體，靶向于ESAT-6的多克隆抗體包被在納米磁珠表面。采用雙抗體夾心法原理，磁性分離結(jié)合物和游離物，采用便攜式高靈敏度低噪聲激發(fā)式熒光檢測(cè)儀檢測(cè)磁性結(jié)合物的熒光強(qiáng)度，從而檢測(cè)待檢樣品中ESAT-6蛋白含量。本發(fā)明適用于臨床病理標(biāo)本中的ESAT-6檢測(cè)，具有快速、靈敏、抗雜散熒光干擾、發(fā)射熒光保存時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)。
【IPC分類】G01N33-68, G01N33-569, G01N21-359
【公開號(hào)】CN104807993
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510202992
【發(fā)明人】周艷容, 陳晨, 王小晉, 王冰, 李燕, 明宏艷
【申請(qǐng)人】廣東國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心（廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局口岸門診部）, 中華人民共和國(guó)淮安出入境檢驗(yàn)檢疫局
【公開日】2015年7月29日
【申請(qǐng)日】2015年4月23日