對修飾后自體表位的抗腫瘤免疫應(yīng)答的制作方法
【專利說明】對修飾后自體表位的抗腫瘤免疫應(yīng)答
[0001] 本發(fā)明主要涉及可用作癌癥免疫療法標(biāo)靶的修飾多肽。所述修飾多肽可用作單克 隆抗體（mAb)療法的疫苗或標(biāo)靶。所述疫苗或mAb可用于治療癌癥。
[0002] 抗腫瘤免疫應(yīng)答的焦點(diǎn)主要集中在產(chǎn)生腫瘤特異性CD8應(yīng)答上，這部分是因?yàn)榇?多數(shù)實(shí)體瘤缺乏MHC II類表達(dá)。因此，這些腫瘤更適合作為⑶8T細(xì)胞的標(biāo)靶，而不是⑶4T 細(xì)胞。但是，CD8T細(xì)胞參與的療法僅對患者表現(xiàn)出中等且短效的應(yīng)答。多年來已知CD4輔助 細(xì)胞在抗體或CD8介導(dǎo)的表位特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中均起到關(guān)鍵作用。據(jù)報(bào)告，若在沒 有CD4輔助的情況下誘導(dǎo)記憶CD8應(yīng)答，則該應(yīng)答被破壞[1、2]。最初以為這是因?yàn)镃D4輔 助細(xì)胞分泌IL-2 [3]，但近來認(rèn)為還因?yàn)闃渫患?xì)胞（DCs)的修飾/激活，從而激活了 CD8細(xì) 胞[4-7]。在大多數(shù)情況下，該輔助是由源自病原或插入疫苗中的外源CD4表位所提供的。 但是，腫瘤位點(diǎn)處也需要腫瘤特異性CD4應(yīng)答來增強(qiáng)發(fā)炎，從而增強(qiáng)對CD8細(xì)胞、NK細(xì)胞和 其他抗腫瘤免疫性炎性介質(zhì)的招募和滯留[8-11]。使用CD4或MHC II類缺陷小鼠的研宄 中，腫瘤進(jìn)程接連發(fā)生，這進(jìn)一步證實(shí)了 CD4輔助T細(xì)胞參與癌癥免疫，表明了 CD4T細(xì)胞在 根除腫瘤中的重要性。更新的文獻(xiàn)報(bào)告暗示了腫瘤反應(yīng)性CD4T細(xì)胞的重要性，它在體內(nèi)腫 瘤根除和腫瘤特異性Thl7細(xì)胞介導(dǎo)的優(yōu)秀腫瘤破壞作用中的直接作用[12-15]。若細(xì)胞庫 不受制于耐受性，則可產(chǎn)生對腫瘤特異性表位的高頻率和親抗原性的CD 4應(yīng)答[16-18]。 若細(xì)胞庫受制于自身耐受性，則對表位特異性CD4應(yīng)答的誘導(dǎo)會受到很大限制，且所得應(yīng) 答頻率和親抗原性低。
[0003] 腫瘤中有若干種腫瘤表位可供標(biāo)靶，包括腫瘤特異性表位和腫瘤相關(guān)表位。前者 因腫瘤的發(fā)生和發(fā)病機(jī)理中獲得的較大DNA片段突變或重復(fù)或刪除而產(chǎn)生。點(diǎn)突變難以被 免疫系統(tǒng)靶定，這是由于它們必須創(chuàng)造出新表位，創(chuàng)造出可與MHC相結(jié)合的新錨定殘基或 與T細(xì)胞或B細(xì)胞受體（TCR或BCRs)反應(yīng)更強(qiáng)烈的新氨基酸。即使突變真的產(chǎn)生了新表 位，也往往僅在少數(shù)個(gè)別合適的MHC單倍型中被識別?；蛑貜?fù)和刪除難以被靶定，因?yàn)樗?們通常是個(gè)別癌癥中獨(dú)特存在的。相反，腫瘤相關(guān)表位是過度表達(dá)的正常表位。所述正常 表位通常在胸腺中直接或通過AIRE酶表達(dá)，且能以高親和性識別這些表位的T細(xì)胞被刪 除或被分化為天然T調(diào)節(jié)細(xì)胞。雖然已發(fā)現(xiàn)了對腫瘤相關(guān)表位的CD8應(yīng)答，對腫瘤相關(guān)表 位的CD4應(yīng)答卻很鮮見，暗示著對這些表位的細(xì)胞庫中，CD4細(xì)胞受到比CD8細(xì)胞更重的調(diào) 控。唯一被發(fā)現(xiàn)的CD4應(yīng)答是針對睪丸癌抗原，其在胚胎發(fā)生期間表達(dá)，但僅在成人的配子 中保持活性，而可能不會受到胸腺耐受，但最新證據(jù)表明，AIRE也可以在胸腺中呈現(xiàn)這些表 位。因此，困難在于找到能夠識別自體表位并攻擊腫瘤的T細(xì)胞庫。
[0004] 發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)了 T細(xì)胞或B細(xì)胞表位經(jīng)某些修飾能得到與未修飾表位相比引 發(fā)免疫應(yīng)答更強(qiáng)的表位。令人吃驚地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)某些修飾后表位與腫瘤相關(guān)，由此可用于 產(chǎn)生針對所述腫瘤的免疫應(yīng)答。
[0005] 在本發(fā)明的第一方面中，提供了用于醫(yī)藥的刺激對腫瘤的免疫反應(yīng)的腫瘤相關(guān)表 位，所述表位經(jīng)過選自如下的修飾：精氨酸到瓜氨酸的脫亞氨基反應(yīng)、酪氨酸硝化反應(yīng)、色 氨酸氧化、谷氨酰胺或天冬酰胺的脫氨基反應(yīng)。本發(fā)明還提供用于癌癥治療方法中的刺激 對腫瘤的免疫反應(yīng)的腫瘤相關(guān)表位，和/或含有編碼所述表位的序列的核酸，所述表位經(jīng) 過選自如下的修飾：精氨酸到瓜氨酸的脫亞氨基反應(yīng)、酪氨酸硝化反應(yīng)、色氨酸氧化、谷氨 酰胺或天冬酰胺的脫氨基反應(yīng)；所述表位，及所述表位和/或核酸在制備用于治療癌癥的 藥物中的用途。本發(fā)明還提供一種治療癌癥的方法，包括將本發(fā)明的表位或核酸向需要改 治療的對象給藥。
[0006] 所述表位可以是T細(xì)胞或B細(xì)胞表位。本發(fā)明中的表位可單獨(dú)或組合使用。此外， 它們還可以和其他治療劑共同使用，例如抗癌藥劑，包括但不限于檢查點(diǎn)阻斷藥物，如易普 利姆瑪（ipilimumab)。
[0007] 優(yōu)選的修飾之一為精氨酸脫亞氨基反應(yīng)形成瓜氨酸。自由精氨酸可以通過真核細(xì) 胞中的氧化亞氮合成酶或細(xì)菌中的精氨酸脫亞氨酶轉(zhuǎn)化為自由瓜氨酸。瓜氨酸是一種修 飾后的氨基酸，但由于其不具有tRNA，無法直接添加入蛋白中，而是來自由肽?；彼崦?亞胺基酶（PAD，存在于各種組織中的酶家族）作用的精氨酸翻譯后修飾。術(shù)語"瓜氨酸化 (citrullination) "或"脫亞氨基（deimination) "指的是精氨酸到瓜氨酸的修飾，可以是 由酶PAD在多肽序列中進(jìn)行的翻譯后修飾。附圖中的圖1中展示了更多細(xì)節(jié)。在精氨酸到 瓜氨酸的反應(yīng)中，精氨酸側(cè)鏈的末端氮原子之一被氧原子取代。該反應(yīng)使用了一個(gè)H 20分 子，生成副產(chǎn)物氨。所述精氨酸到瓜氨酸的轉(zhuǎn)化可以對蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有重要影響，因?yàn)?精氨酸在中性pH下帶正電，而瓜氨酸則不帶電荷。隨著蛋白疏水性的增加，蛋白折疊也可 能發(fā)生變化。PAD酶有5種，稱為PAD 1、2、3、4和6。雖然它們高度同源，在氨基酸水平上 具有5-60 %的序列一致性，但卻具有不同的位點(diǎn)（PAD1-表皮和子宮；PAD2-大腦，女性生 殖道，骨骼肌和造血細(xì)胞；PAD3-毛囊和上皮；PAD4-造血細(xì)胞，肺，食道，乳腺和卵巢癌；PAD 6_卵母細(xì)胞和植入前胚胎[19])。雖然與靶蛋白有些重疊，但每個(gè)家族成員還似乎能夠靶 定獨(dú)有的一套細(xì)胞蛋白。這是由精氨酸的表面裸露和聚簇決定的，使它們成為良好標(biāo)靶和 優(yōu)選的氨基酸側(cè)翼序列。對于PAD4,位點(diǎn)-2和+2上優(yōu)選為非極性小氨基酸，且精氨酸側(cè)翼 的脯氨酸防止瓜氨酸化[20, 21]。因此，不是蛋白質(zhì)中的所有精氨酸都瓜氨酸化，不是所有 精氨酸都在MHC抗原呈現(xiàn)以供T細(xì)胞識別。
[0008] 在本發(fā)明中，可用于刺激抗癌免疫的瓜氨酸化表位源自BiP、NY-ES0-1、MMP7、細(xì) 胞角蛋白、]^(：1、〇￡八.〇八15、〇)59、1^12、0-連環(huán)蛋白、〇父(^8、〇父(^1〇、〇父(^12、（1烯醇酶、 髓鞘堿性蛋白、組蛋白、核磷酸蛋白、B23、共活化劑復(fù)合體、抗凝血酶、aggregan、延長因 子la、腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白（CAP1)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白、ALDH2、軟骨中間層蛋白（CLIP)、 醛縮酶、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、鈣網(wǎng)蛋白、HSP60、HSP90、遠(yuǎn)端上游元件結(jié)合蛋白1和 2(FUSE-BPs)、無孢蛋白、組織蛋白酶D、肝素結(jié)合蛋白、肌動蛋白、F-肌動蛋白、加帽蛋 白a-1亞單位（CapZ a-1)、白蛋白、組胺受體、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶ER60前體、線粒體醛脫 氫酶（ALDH2)和糖原合成酶激酶3f3 (GSK3 0)。所述蛋白的通用蛋白庫（Uniprot)索引如 附圖中的圖32所示。
[0009] 針對各種瓜氨酸化蛋白（包括絲聚合蛋白、膠原蛋白、a-烯醇酶、纖維蛋白原和 波形蛋白）的抗體被發(fā)現(xiàn)于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)病患中，并可用作診斷該疾病的特異性標(biāo) 記[22-24]。最近，若干其他瓜氨酸化蛋白被描述為RA病患中的抗體標(biāo)靶，包括組蛋白、 核磷酸蛋白、B23、共活化劑復(fù)合體、抗凝血?jiǎng)?、aggregan、延長因子1 a、腺苷酸環(huán)化酶相 關(guān)蛋白（CAP1)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白、ALDH2、軟骨中間層蛋白（CLIP)、醛縮酶、磷酸甘油酸激 酶1(PGK1)、鈣網(wǎng)蛋白、HSP60、HSP90、BiP、遠(yuǎn)端上游元件結(jié)合蛋白1和2(FUSE-BPs)、無 孢蛋白、組織蛋白酶D、肝素結(jié)合蛋白、肌動蛋白、F-肌動蛋白、加帽蛋白a-1亞單位 (CapZ a -1)、白蛋白、組胺受體、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶ER60前體、線粒體醛脫氫酶（ALDH2)
[49]。此外，據(jù)假定，瓜氨酸自身不足以生成變異反應(yīng)，而瓜氨酸周圍的氨基酸對確定表位 的抗原性則是必要的[25-27]。
[0010] 除瓜氨酸化外，本發(fā)明中的數(shù)種其他翻譯后修飾也在MHC結(jié)合的多肽中觀察到， 包括酪氨酸殘基的硝化[28]和色氨酸殘基的氧化[29]。巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的激活，包 括生成氧化亞氮和其他活性氧類。蛋白質(zhì)的裸露可以帶來酪氨酸的硝化和色氨酸的較低程 度硝化。據(jù)顯示，CD4細(xì)胞在雞卵溶菌酶來源的表位上特異識別所述修飾[29]。但是，尚未 確定硝化表位在任何疾病中的作用。前列腺腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞中存在的高水平硝化酪氨 酸，暗示著過氧亞硝基的本地生成。精氨酸代謝中的關(guān)鍵酶在惡性前列腺組織中高度表達(dá) 但在正常前列腺中則否，抑制精氨酸酶和氧化亞氮合成酶活性，降低酪氨酸硝化和腫瘤浸 潤性淋巴細(xì)胞的恢復(fù)[30]。谷氨酰胺或天冬酰胺的脫氨基化可能是因?yàn)槔匣?，但該修飾?顯著部分是因酶機(jī)理而產(chǎn)生。脫氨基化形成了主要帶負(fù)電荷的側(cè)鏈（谷氨酸鹽或天冬氨酸 鹽），并改變了谷氨酰胺和天冬酰胺形成氫鍵的能力。天冬酰胺可以通過N-聚糖酶轉(zhuǎn)化為 天冬氨酸鹽，因此，該修飾與N-糖基化反應(yīng)緊密相連。谷氨酰胺殘基可以通過組織轉(zhuǎn)谷氨 酸鹽酶來脫氨基。來自飲食小麥蛋白中的谷氨酰胺脫氨基化，是乳糜瀉疾病（一種與遺傳 導(dǎo)致的個(gè)體谷蛋白不耐受相關(guān)的自免疫疾?。┑暮诵?。HLA單倍型、DQ2和DQ8對脫氨基化 的醇溶蛋白多肽具有強(qiáng)親和性，并刺激T細(xì)胞對胃腸道內(nèi)壁的應(yīng)答[31]。
[0011] 本發(fā)明的表位可以包括以下序列、由其組成或主要由其組成：
[0012]IQKLYGKRS，優(yōu)選為 SQDDIKGIQKLYGKRS (MMP7-247)，
[0013]NILTIRLTAA，優(yōu)選為 PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR (NYES0-1-119)，
[0014]LTIRLTAA，優(yōu)選為 PGVLLKEFTVSGNI LT I RLTAADHR (NYESO-1-l 19)，
[0015]EIRELQSQ，優(yōu)選為 EEEIRELQSQISDTSVVLS (cytokeratin8229_247)，
[0016]AKQDMARQLREYQEL，優(yōu)選為 AKQDMARQLREYQELMNVKL (cytokeratin8:363-382)，
[0017]AKQDMARQ，優(yōu)選為 LQRAKQDMARQLREYQELM (cytokeratin8:360-378)，
[0018]ISSSSFSRV，優(yōu)選為 PGSRISSSSFSRVGSS (cytokeratin8:29-44)，
[0019] PRAFSSRS，優(yōu)選為 STSGPRAFSSRSYTSGPG (cytokeratin8:13-30),
[0020]EAALQRAKQ，優(yōu)選為 ELEAALQRAKQDMARQL (cytokeratin8:355-371)，
[0021] LEVDPNIQAVRTQE，優(yōu)選為 LEVDPNIQAVRTQEKEQI (cytokeratin8:78-95)，和
[0022] QKKLKLVRT，優(yōu)選為 AQKKLKLVRTSPEYGMP (ING4158-174)，
[0023] LKLVRTSPE，優(yōu)選為 AQKKLKLVRTSPEYGMP (ING4158-174)，
[0024] KKLKLVRTS，優(yōu)選為 AQKKLKLVRTSPEYGMP (ING4158-174)，
[0025] YMSSARSLS，MSSARSLSS 或 TEYMSSARS，優(yōu)選為 KLATEYMSSARSLSSEEK (ING444-58)，
[0026]FDLFENRKK，優(yōu)選為 RAPFDLFENRKKKNN (HSP90-346-360)，
[0027]YLNFIRGVV 或 FIRGVVDSE，優(yōu)選為 IPEYLNFIRGVVDSE (HSP90-378-392)，
[0028] LRYYTSASG， LLRYYTSAS 或 LSELLRYYT，優(yōu)選為 RKKLSELLRYYTSAS⑶EMVSL(H SP90-456-477)，
[0029] RRRLSELLRYHTSQS(HSP90beta456_460)，
[0030]VGVFKNGRV 或 FKNGRVEII，優(yōu)選為 YSCVGVFKNGRVEII (BiP39-53)，
[0031]YFNDAQRQA，優(yōu)選為 VPAYFNDAQRQATKDA (BiP172-186)，
[0032]VTFEIDVNG，優(yōu)選為 EVTFEIDVNGILRVT (BiP497-511)，
[0033]ITNDQNRLT，優(yōu)選為 KITITNDQNRLTPEE (BiP522-536)，
[0034]LQIVARLKN 或 VARLKNNNR，優(yōu)選為 NCALQIVARLKNNNR (CXCL12-54-68)，
[0035] VEIIATMKK 或 RVEIIATMK，優(yōu)選為 CPRVEIIATMKKKGE (CXCL1057-71)。
[0036] 其中，一個(gè)或多個(gè)R殘基被替代為瓜氨酸。在NYES0-1-119中，優(yōu)選地，第一個(gè)R 殘基（位點(diǎn)136)被瓜氨酸取代。在細(xì)胞角蛋白8 :360-378中，優(yōu)選地，第二個(gè)R殘基（位 點(diǎn)369)被瓜氨酸取代。在細(xì)胞角蛋白8:29-44中，優(yōu)選地，第二個(gè)R殘基（位點(diǎn)40)被瓜 氨酸取代。在HSP90、BiP、ING4、CXCL10和CXCL12中，優(yōu)選地，序列中所有R殘基被瓜氨 酸取代。本發(fā)明還在進(jìn)一步的方面中提供了所述表位。特別地，本發(fā)明提供了含有序列 YVTTSTc i tTYSLGSALc i t或由該序列組成或主要由該序列組成，且可選地含有序列
[0037] citSYVTTSTcitTYSLGSALcitPSTS(vim28-49)或由該序列組成或主要由該序列組 成的多肽，其中cit代表瓜氨酸。
[0038] 本發(fā)明的優(yōu)選表位之一源自波形蛋白，且瓜氨酸化。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，來自波形 蛋白的瓜氨酸化表位可用作產(chǎn)生對腫瘤的免疫應(yīng)答，包括但不限于，黑色素瘤、乳腺癌、子 宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸直腸癌和卵巢癌。
[0039]來自波形蛋白的優(yōu)選表位含有VTTSTRTYSLGSALR(波形蛋白30-45)、由其組成或 主要由其組成，其可以可選地瓜氨酸化。其中兩個(gè)精氨酸之一或兩者均可以瓜氨酸化。該 表位可以包括RSYVTTSTRTYSLGSALRPSTS (波形蛋白28_49)、由其組成或主要由其組成，其 可以可選地瓜氨酸化。其中三個(gè)精氨酸中的任一個(gè)、任兩個(gè)或所有三個(gè)可以瓜氨酸化。優(yōu) 選地，所有三個(gè)R殘基皆為瓜氨酸化。第二個(gè)R殘基（位點(diǎn)36)可以被瓜氨酸取代。
[0040] 源自波形蛋白的可選表位包括至少一個(gè)以下序列、由其組成或主要由其組成：
[0041]VRLRSSVPG 或 RLRSSVPGV，優(yōu)選為 SAVRLRSSVPGVR (vim65_77)，和
[0042] FSSLNLRET，優(yōu)選為 LPNFSSLNLRETNLDSLPL (vim415_433)，
[0043] 其中一個(gè)或多個(gè)所述R殘基被瓜氨酸取代。在vim65-77中，優(yōu)選地，第二個(gè)R殘 基（位點(diǎn)70)被瓜氨酸取代。源自波形蛋白的更多可選表位包括至少一個(gè)以下序列、由其 組成或主要由其組成：
[0044] RSSVPGVRL, SAVRLRSSV, ATRSSAVRL, YATRSSAVRLRSSVPGVRL (vim61-79),
[0045] RSSVPGVRL, GVRLLQDSV, RLRSSVPGVRLLQDSVDFS (vim69-87),
[0046] QLKGQGKSR, KSRLGDLYE, EQLKGQGKSRLGDLYEEEM(viml25-154),
[0047] ELRRQVDQL, EMRELRRQV, DLYEEEMRELRRQVDQLTN(viml48-166),
[0048] QLTNDKARV, VEVERDNLA, LTNDKARVE, VDQLTNDKARVEVERDNLA (viml61-179),
[0049] EVERDNLAE, NDKARVEVERDNLAEDIMR(viml66-184),
[0050] IMRLREKLQ, DNLAEDIMRLREKLQEEML(viml76-194),
[0051]QEEEAENTL，KLQEEMLQS，EKLQEEMLQSEEAENTLQS (viml87-205)，和 / 或
[0052] FRQDVDNAS, ENTLQSFRQ, EAENTLQSFRQDVDNASLA (viml98-216),
[0053] 其中一個(gè)或多個(gè)所述R殘基可以被瓜氨酸取代。在上述序列中，優(yōu)選被瓜氨酸取 代的R殘基以下劃線標(biāo)出。核心序列顯示在表位之前。
[0054] 本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供了包含序列YVTTSTRTYSLGSALR、由其組成或主要由其 組成的表位，且可選地，包含序列RSYVTTSTRTYSLGSALRPSTS(vim28_49)，和/或編碼所述表 位的核酸，以用于治