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對修飾后自體表位的抗腫瘤免疫應(yīng)答的制作方法_5

文檔序號:8501008閱讀:來源:國知局
皮 下給藥免疫接種。(i) (b)第4、11和18天,用對照抗體DNA,或在⑶RH3編碼HLA-DR4限制 性vim28輔助表位的抗體DNA疫苗,或以MPLA和CPG為佐劑的瓜氨酸化或野生型波形蛋白 28-49多肽(25 yg),使用基因槍對小鼠皮下給藥免疫接種。(c)用以MPLA和CPG為佐劑 的瓜氨酸化波形蛋白415-433多肽(25 y g)或波形蛋白28-49或兩者(25 y g),對小鼠皮 下給藥免疫接種。(d)用以MPLA和CPG為佐劑的瓜氨酸化波形蛋白415-433多肽(25 y g) 聯(lián)合抗CD4抗體(克隆GK1. 5),對小鼠皮下給藥免疫接種。
[0148] (e)用以MPLA和CPG為佐劑的瓜氨酸化波形蛋白28-49多肽(25 y g)聯(lián)合抗CD4 抗體(克隆GK1. 5),對小鼠皮下給藥免疫接種。
[0149] 圖25:瓜氨酸化波形蛋白415-433和波形蛋白28-49的抗腫瘤免疫應(yīng)答部分由 IFNy 和 IL-17 介導(dǎo)。
[0150] 第0天,向HLA-DR4轉(zhuǎn)基因小鼠注射2. 5x 104B16F1-DR4細胞。用以MPLA和CPG 為佐劑的(a和c)瓜氨酸化波形蛋白415-433多肽(25 y g)或(b和d)波形蛋白28-49多 肽(25 y g);在存在或不存在IFN y中和單克隆抗體(a和b)或IL-17中和抗體(c和d)的 情況下,對小鼠進行皮下免疫接種。
[0151] 圖26:瓜氨酸化波形蛋白415-433抗腫瘤免疫應(yīng)答,而非波形蛋白28-49抗腫瘤 免疫應(yīng)答,部分受到腫瘤細胞上的HLA-DR0401的直接識別的介導(dǎo)。
[0152] 第0天以(a)2. 5x 104B16F1細胞或(b)B16Fl-DR4細胞注射HLA-DR4轉(zhuǎn)基因小鼠。 以(a)以MPLA和CPG為佐劑的瓜氨酸化波形蛋白415-433多肽(25 y g)或波形蛋白28-49 多肽(25 y g)或兩者;(b)以MPLA和CPG為佐劑的波形蛋白415-433多肽(25 y g),在存在 或不存在HLA-DR0401中和單克隆抗體的情況下,對小鼠進行皮下免疫接種。
[0153] 圖27 :不同物種間的波形蛋白同源性。
[0154] 圖28:篩選波形蛋白中刺激T細胞應(yīng)答的新型表位。
[0155] 用以MPLA和CPG為佐劑的人瓜氨酸化細胞角蛋白多肽(3x 10 y g)皮下給藥。a) HLA-A2/DR1和b)C57/Bl mice小鼠免疫接種14天后,通過對輔助多肽和無關(guān)對照的(i) IFNy和(ii)IL-17酶聯(lián)免疫斑點實驗來檢測脾細胞對輔助表位的特異性應(yīng)答。C)用以 MPLA和CPG為佐劑的瓜氨酸化viml4多肽皮下給藥。免疫接種14天后,通過對輔助多肽和 無關(guān)對照的IFNy酶聯(lián)免疫斑點實驗來檢測脾細胞對輔助表位的特異性應(yīng)答。應(yīng)答測定為 斑點/百萬脾細胞。
[0156] 圖29:篩選細胞角蛋白8中刺激T細胞應(yīng)答的新型表位。
[0157] 用以MPLA和CPG為佐劑的人瓜氨酸化細胞角蛋白多肽(3x 10 y g)皮下給藥。a) HLA-A2/DR1和b)C57/Bl mice小鼠免疫接種14天后,通過對輔助多肽和無關(guān)對照的(i) IFNy和(ii)IL-17酶聯(lián)免疫斑點實驗來檢測脾細胞對輔助表位的特異性應(yīng)答。應(yīng)答測定 為斑點/百萬脾細胞。
[0158] 圖30:野生型波形蛋白刺激分泌IL-10的iTreg細胞應(yīng)答。
[0159] 用以MPLA和CPG為佐劑的人415波形蛋白多肽(25 y g)皮下給藥。HLA-DR4小鼠 免疫接種14天后,通過對輔助多肽和無關(guān)對照的(i)IFNy,(ii)IL_17和(iii)IL-lO酶聯(lián) 免疫斑點實驗來檢測脾細胞對輔助表位的特異性應(yīng)答。應(yīng)答測定為斑點/百萬脾細胞。
[0160] 圖31:瓜氨酸化ING4刺激⑶4應(yīng)答。
[0161] 第0、7、14天,用以MPLA和CPG為佐劑的瓜氨酸化ING4多肽158-174多肽(25 y g) 皮下給藥。對HLA-A2/DR1最后一次免疫接種后7天,在存在或不存在HLA-DR阻斷單克隆 抗體的情況下,用對輔助多肽的IFN Y酶聯(lián)免疫斑點實驗測試HLA-A2/DR1小鼠脾細胞對輔 助表位的特異性應(yīng)答。應(yīng)答測定為斑點/百萬脾細胞。
[0162] 圖32:本發(fā)明中可用表位的蛋白質(zhì)在通用蛋白質(zhì)庫中的來源索引。
[0163] 圖33:全抗原波形蛋白DNA誘導(dǎo)瓜氨酸化波形蛋白特異性T細胞應(yīng)答。在第0、7、 14天,通過基因槍以lyg編碼全鼠波形蛋白序列的DNA對(a)HLA-DR4轉(zhuǎn)基因小鼠或(b) HLA-A2/DR1轉(zhuǎn)基因小鼠進行免疫接種。第20天,通過酶聯(lián)免疫斑點實驗,分析脾細胞對一 組跨全蛋白的瓜氨酸化波形蛋白多肽的IFNy應(yīng)答。應(yīng)答測定為斑點/百萬脾細胞。
[0164] 圖34:預(yù)測多肽的瓜氨酸特異性免疫應(yīng)答的篩選。
[0165] 第0、7、14天用以CpG和MPLA佐劑的源自BiP,HSP90和ING4的預(yù)測瓜氨酸化多 肽(25ug)對HLA-DR4轉(zhuǎn)基因小鼠進行皮下給藥。第14天或20天,通過IFNg酶聯(lián)免疫斑 點實驗,分析脾細胞對相關(guān)瓜氨酸化和未修飾多肽(5uM)和背景對照的免疫應(yīng)答。應(yīng)答測 定為平均斑點/百萬脾細胞。
[0166] 方法
[0167] 2. 1?市售 mAbs
[0168] 從Abeam購入一級兔抗人波形蛋白(克隆EPR3776)、兔抗人PAD2(克隆pab0197)、 兔抗人瓜氨酸(克隆ab6464)。從Covalab購得一次兔抗人PAD-4 (克隆pab 0199)并從 eBioscience 購得抗人 HLA-DR PE-Cy7 標記抗體(克隆 L243)。從 BioXcell 購得抗-CD25 抗體(克隆PC61)、抗IFNy抗體(克隆XMG1. 2)、抗IL-17(克隆17F3)抗體和抗⑶4(克隆 GK1. 5)抗體。通過瓊脂糖蛋白G親和層析法從HB304雜交瘤細胞培養(yǎng)物上清液(ATCC,USA) 中純化抗CTLA4抗體。通過瓊脂糖蛋白G親和層析法從HB-55雜交瘤細胞培養(yǎng)物上清液 (ATCC, USA)中純化抗 HLA-DR 抗體。從 Cell Signaling Technology 公司購入兔 mAb 抗 HMGB1 (克隆 D3E5)。
[0169] 2. 2.細胞系
[0170] T細胞/B細胞雜交細胞系T2[80]以功能II型DR4(DRB1*0401 ;T2DR4)或 DR1(DRB1*0101 ;T2DR1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染在文獻中已有記述[82, 83],并由Janice Blum博士和 Lawrence Stern教授友情提供。小鼠黑色素瘤B16F1和B16F10細胞系來自ATCC。除非另有 說明,否則所有細胞系均在補充了 10% FCS、L-谷氨酰胺(2mM)和碳酸氫鈉緩沖液的RPMI 培養(yǎng)基1640(GIBC0/BRL)中培養(yǎng)。HB304雜交瘤細胞在雜交瘤SFM(Invitrogen,UK)中進 行培養(yǎng)。為了生成呈遞瓜氨酸化表位的腫瘤標靶用于體外分析,4°C下以含1% BSA的0. 1M 檸檬酸(PH3.0)處理細胞2分鐘,然后以培養(yǎng)基洗滌細胞,并37°C無血清培養(yǎng)20小時。該 20小時無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)中,添加了自噬和PAD抑制劑,即終濃度分別為10nM和50 y g/ml 的 3_ 甲基腺嗓呤(Sigma)和 CI-脒(Calbiochem)。
[0171] 2.3.免疫原
[0172] 2. 3.1 多肽
[0173] 通過多肽合成材料$3代1^111,111()合成大于90%純度的多肽。-80<€凍干|£藏在 0. 2mg小份中。使用時,以10%二甲基甲酰胺重建適當(dāng)濃度。
[0174] 2. 4?質(zhì)粒
[0175] 其他文獻已詳細敘述了抗體DNA結(jié)構(gòu)的生成[84]。簡單而言,為了生成抗體DNA 結(jié)構(gòu),使用標準分析生物學(xué)技術(shù)將表位并入抗體的輕鏈可變域和重鏈可變區(qū)的互補決定 區(qū)中。將來自表位酪氨酸酶448-462 (DYSYLQDSDPDSFQD)、鼠和人HLA-DR4gp100 44-59表 位(WNRQLYPEWTEVQGSN/WNRQLYPEWTEAQRLD)和來自 IfepB 核蛋白 128-140 (TPPAYRPPNAPIL) 的I-Ab限制性表位限制性輔助CD4表位插入取代k鏈的CDRL1。相似地,來自表位 MMP7247-262(SQDDIKGQKLYGKRS)、SSX233-48(KEEWEKMKASEKIFY)、NYES0-1 87-111(LLEFYL AMPFATPMEAELARRSLAQ)和 119-143(PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR)的 HLA-DR1 限制性輔助 CD4表位并入CDRL1,而來自表位磷酸丙糖異構(gòu)酶23-37 (GELIGILNAAKVPAD)的修飾后表位 被插入取代k鏈的 CDRL3。HLA-DR4 限制性 CD4 波形蛋白 415-433(LPNFSSLNLRETNLDSLPL) 和 HLA-DR1 28-49(RSYVITSTRTYSLGSALRPSTS)限制性表位均被并入 CDRH3。 DR1CD4NYES0-1 87-111 (LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ)也被編碼在克隆入抗體 DNA 雙表達 載體中的擴展序列83-111中。還生成了含有全部3種波形蛋白表位的人IgGl和鼠IgG2a免 疫體載體。HLA - DR128-49 (RSYVITSTRTYSLGSALRPSTS)、65-77 (SAVRLRSSVPGVR)和 HLA-DR4 限制性人CD4波形蛋白415-433(LPNFSSLNLRETNLDSLPL)表位分別并入CDRH1、CDRH2和 CDRH3。
[0176] 將來自從B16F1細胞系分離得到的mRNA的全長序列作為模版cDNA,通過擴增生成 質(zhì)粒pVaxI鼠全長波形蛋白。所用的正反向引物分別設(shè)計為并入Hindlll和BamHI位點。通 過野生型序列的擴增和確認,將全長鼠波形蛋白并入哺乳類表達載體pVaxIdnvitrogen) 的多克隆位點的Hindlll/BamHI位點。
[0177] 為了生成質(zhì)粒pVitro 2,從轉(zhuǎn)基因HLA-DR4小鼠的脾細胞中分離得到mRNA,并以 此生成嵌合HLA-DR4cDNA。將其用作模版,以分別含有fspI/EcoRI和BamHI/Sall位點的正 向和反向引物來分別擴增嵌合a鏈和0鏈。在序列確認中,由鼠H2_Ea和HLA-DRAa 1域 組成的人全長嵌合a鏈結(jié)合在載體pVITR02-hygro_mcs(Invivogen)的fspI/EcoRI mcs2 位點中。由鼠H2-Eb和人DRB1*0401 M域組成的0鏈隨后與嵌合a鏈一同插入載體的 BamHI/Sall mcsl 位點。
[0178] 為了生成HHD質(zhì)粒,從EL4-HHD細胞分離全RNA并以此合成cDNA。將其用作模版以 利用正向和反向引物擴增HHD,并亞克隆入pCR2. 1中。隨后將HHD鏈插入購自invitrogen 的哺乳類表達載體P⑶NA3. 1的EcoRV/Hindlll位點,所述HHD鏈包括人HLA-A2前導(dǎo),和通 過甘氨酸絲氨酸連接子共價連接至人HLA-0201MHC 1類分子的a 1和2域及小鼠H-2Db 1 類分子的a 3跨膜和胞漿區(qū)的人B2微球蛋白分子。
[0179] 為了構(gòu)建編碼鼠Tap2和NYES0-1全長鏈的哺乳類雙表達質(zhì)粒,用從geneservice 公司購得的IMAGE克隆40146393以分別包含BamHl/XhoI位點的正向和反向引物擴增 NYES0-1。在序列確認中,將全長NYES0-1連接到抗體DNA雙表達載體的BamHI/Xhol多克 隆位點上,取代輕鏈。用從編碼序列移除了 Hindlll位點并將其插入在起始密碼子前的映 像克隆6530488來擴增鼠Tap2,并使用Hindlll/EcoRV將其克隆入表達載體pOrigHIB。然 后,使用Hindlll/AvrII將鼠Tap2與全長NYES0-1 -道轉(zhuǎn)移至雙表達載體中,取代重鏈。
[0180] 為了降低鼠B2微球蛋白和鼠MHCII類在細胞系B16F10中的表達,使用了RNA干 擾。將靶定鼠B2微球蛋白的序列266和鼠MHCII類序列159的互補寡核苷酸退火并分別 插入PCDNA6.2GWmiR(Invitrogen)中。使用BamHI/Xhol切離含有miRNA266 的miRNA前 體表達組件,并連接到PCDNA6. 2GWmiR159的Xhol/Bglll位點上,以將兩條miRNA鏈連接 在一起,并在相同載體中的初級轉(zhuǎn)錄物中表達。
[0181] 使用Qiagen無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(endofree Qiagen maxiprep kit, Qiagen, Crawley)生成不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA〇
[0182] 2. 5.轉(zhuǎn)染
[0183] 使用質(zhì)粒體轉(zhuǎn)染劑以編碼全長NY-ES0-1和鼠Tap2、HHDII和siRNA的表達載體, 相繼轉(zhuǎn)染B16F10細胞,以降低鼠MHC II類和鼠0 2微球蛋白的表達。轉(zhuǎn)染后的細胞分別 在博來霉素(300 y g/ml)、G418 (500 y g/ml)和殺稻瘟菌素(4 y g/ml)的存在下進行生長選 擇。通過有限稀釋法克隆細胞系,并通過流式細胞儀確認表達。
[0184] 根據(jù)廠商說明,使用質(zhì)粒體轉(zhuǎn)染劑(Invitrogen)以4 y g編碼全長嵌合a和]3 鏈的質(zhì)粒pVitro 2嵌合HLA-DR401來轉(zhuǎn)染B16F1細胞。在潮霉素B(200 y g/ml)的存在 下選擇轉(zhuǎn)染細胞的生長。通過有限稀釋法克隆細胞系,并使用購自eBioscience的HLA-DR PE-Cy7標記抗體(克隆L243)抗人通過流式細胞儀確認表達。
[0185] 2. 6HLADR0401 結(jié)合實驗
[0186] 簡單而言,將濃度遞增的實驗多肽與預(yù)定濃度的生物素化HA 3(16_318對照多肽混 合,并添加到固定在板上的HLADR0401中。與HLA DR0401結(jié)合的生物素化對照多肽的量, 使用鏈霉親和素標記酶步驟和隨后的顯色底物檢測來進行量化。將生物素化HA 3(16_318多肽 單獨達到的數(shù)值看作最大結(jié)合度。作為陽性對照,未標記HA 3(16_318多肽用于與生物素化HA 306-318多肽競爭。
[0187] 2. 7.免疫接種
[0188] 2. 7.1免疫接種方案
[0189] 使用了 8-12 周齡的 C57BL/6 小鼠(Charles River, UK)、HLA-DR4 小鼠 (Taconic,USA)、HHDII 小鼠(Pasteur institute, France)和 HHDII/DR1 小鼠(Pasteur institute, France),由諾丁漢倫特大學(xué)(Nottingham Trent University)的員工照顧。所 有工作均由英國內(nèi)政部項目許可證授權(quán)。將多肽在10%二甲基甲酰胺中制為lmg/ml溶液 并以不同佐劑進行乳化(系列稀釋):CpG和MPLA各為6 y g/小鼠(Invivogen, UK)、弗氏 不完全佐劑50 y 1/小鼠(Sigma, UK),以及GMCSF 10 y g/小鼠(P印rotech,UK)。在尾根處 皮下注射多肽(25 y g/小鼠)。根據(jù)廠商說明將DNA(1 y g/小鼠)涂布在1. 0 ym金顆粒 (BioRad,Hemel Hempstead, UK)上,并以基因槍(BioRad)皮內(nèi)給藥。使用基因槍皮下注射 地免疫接種Homspera(10nM/小鼠)(PeptideSynthetics, UK)。小鼠在第0天免疫接種多 肽,或在第0、7、14天進行多肽和基因槍免疫接種。除非另有說明,否則第14天摘除脾臟并 分析多肽,第20天則摘除分析多肽或基因槍接種。免疫接種前3天,以含400 y g抗CD25 抗體(PC61)的鹽水腹腔注射(i.p.)給藥。免疫接種第7和第14天,用基因槍或多肽免疫 接種以含200 yg抗CTLA-4抗體(UC10-4F10-11)的鹽水腹腔注射(i.p.)給藥。
[0190] 對于腫瘤激發(fā)實驗,在基礎(chǔ)免疫3天前,以2. 5xl04B16HHDII NYES0/TAP2si 0 2m 1F10細胞或B16 DR4 2E7細胞對小鼠進行右側(cè)皮下給藥,然后如上所述地進行免疫。腫瘤 植入后第2、7、11和14天,以含抗IFNy抗體(300 y g/劑)、抗IL-17抗體(200 y g/劑) 和抗HLA-DR抗體(300 y g/劑)的鹽水進行腹腔注射給藥。在腫瘤植入后的第2和8天以 含抗CD4抗體(500 y g/劑)的鹽水進行腹腔注射給藥。以3-4天為間隔時間監(jiān)控腫瘤生 長,一旦腫瘤直徑達到彡l〇mm,即將小鼠安樂死。
[0191] 2.8.免疫應(yīng)答分析
[0192] 2. 8. 1間接體內(nèi)酶聯(lián)免疫斑點法分析
[0193] 根據(jù)廠商說明(Mabtech,Sweden),使用IFNy、I
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