[0219]在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語“非整倍性狀態(tài)”涉及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核DNA的異常量。
[0220]為了獲得可靠的結(jié)果，細(xì)胞核DNA的量和之后的推斷的癌細(xì)胞的光密度圖(直方圖)優(yōu)選地從一群細(xì)胞計(jì)算，并且優(yōu)選地測量大約100至700個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選地大約100至300個(gè)細(xì)胞。
[0221]如果檢查例如來自肝組織的癌細(xì)胞，將會(huì)例如獲得具有兩個(gè)主峰的光密度圖，對(duì)應(yīng)值為2和4。然而，除了非癌細(xì)胞的情況之外，所述兩個(gè)主峰光密度圖不會(huì)是尖且窄的，而是寬的。另外，會(huì)在所述光密度圖中觀察到低于2、高于2、低于4和高于4的峰和信號(hào)。圖2不出了一個(gè)實(shí)例。
[0222]由于在任何實(shí)例中大多數(shù)細(xì)胞的DNA含量是2，偏離所述大多數(shù)也可以被認(rèn)為是異?；蚩梢傻?。在癌樣品的情況中(正常細(xì)胞是少數(shù))，在DNA含量方面仍有可以用于將所述樣品標(biāo)記為可疑的大的差異。
[0223]因此如果基于根據(jù)本發(fā)明如上文描述的所獲得的細(xì)胞核UV吸收計(jì)算的光密度圖顯示峰信號(hào)在相應(yīng)于值為2 (和4，依賴于所述細(xì)胞在其正常狀態(tài)中的增殖狀態(tài))的峰之外，可以將一個(gè)細(xì)胞評(píng)為癌性的。
[0224]然而，相應(yīng)于值為2 (和4)的峰其本身可能也提示細(xì)胞的癌性可能，如果它們顯示較寬的曲率的話。為了根據(jù)相應(yīng)于值為2(和4)的峰型確定一幅光密度圖是否確實(shí)提示癌癥發(fā)展，可以將推斷的癌細(xì)胞樣品的光密度圖與上文描述的標(biāo)準(zhǔn)或參考光密度圖疊加。
[0225]在提示標(biāo)準(zhǔn)光密度圖的值2和4的光密度圖的峰的曲線下的區(qū)域(area underthe curve, AUC)被認(rèn)為提示非癌細(xì)胞，并且任何偏離推斷的癌細(xì)胞的光密度圖的相應(yīng)峰的AUC至少10%被認(rèn)為提示癌細(xì)胞或狀態(tài)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述偏離至少是15%、至少是20%、至少是25%、至少是30%、至少是40%或至少是50%。
[0226]也可以應(yīng)用在Haroske et.al."1997ESACP consensus report on diagnosticDNA image cytometry", Analytical Cellular Pathology 17(1998) 189-200 中列出的標(biāo)準(zhǔn)，其中解釋了當(dāng)細(xì)胞被認(rèn)為是正常的或癌性的時(shí)的詳細(xì)情況。
[0227]因此，可疑癌細(xì)胞(群)的細(xì)胞核UV吸收/細(xì)胞核信號(hào)強(qiáng)度與從相當(dāng)?shù)姆前┘?xì)胞類型獲得的細(xì)胞核UV吸收的對(duì)比提示正在進(jìn)行的或未來可能的癌癥發(fā)展。
[0228]為了本發(fā)明的目的，DNA含量的顯著異常被認(rèn)為提示癌癥發(fā)展，如果可疑癌細(xì)胞的倍性狀態(tài)偏離倍性值2(和4，如果所述細(xì)胞在其健康狀態(tài)中是增殖的)至少10%的話。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述偏離至少是15%、至少是20%、至少是25%、至少是30%、至少是40%或，至少是50%。光密度圖中的一個(gè)峰代表值為2或4，對(duì)于這個(gè)峰的與在參考光密度圖中的相應(yīng)峰相同的部分。
[0229]相應(yīng)于已有實(shí)踐，如果相應(yīng)于參考光密度圖的值為2的峰的峰范圍為從1.8至2.2，可以將細(xì)胞的DNA含量稱作近似二倍體(peridiploid)。
[0230]如果相應(yīng)于參考光密度圖的值為4的峰的峰范圍為從3.6至4.4，可以將細(xì)胞的DNA含量稱作近似四倍體(peritetraploid)。
[0231]在這些范圍之外的值均被認(rèn)為是X-倍體。
[0232]為了本發(fā)明的目的，具有近似二倍體、近似四倍體和X-倍體值的細(xì)胞和組織被認(rèn)為是癌細(xì)胞。
[0233]因此，上文描述的方法可以用于通過將用本發(fā)明的方法對(duì)于推斷的癌細(xì)胞獲得的細(xì)胞核UV吸收與使用相同方法對(duì)于已知為非癌性的相當(dāng)?shù)募?xì)胞類型獲得的細(xì)胞核UV吸收對(duì)比計(jì)算生物樣品中的推斷的癌細(xì)胞的倍性(非整倍性)狀態(tài)。
[0234]為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“非癌性的(non-canceixms)”是指已知不提示癌癥發(fā)生的細(xì)胞。
[0235]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌細(xì)胞可以與選自包括白血病、淋巴瘤、腦癌、腦脊液癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、腎癌、口腔及喉癌、食管癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌和黑素瘤的一組的癌癥相關(guān)。
[0236]診斷方法
[0237]如上文所述，本發(fā)明也涉及診斷和/或預(yù)測人或動(dòng)物對(duì)象體內(nèi)癌癥的體外方法，所述方法包括如下步驟:
[0238]a)提供得自人或動(dòng)物對(duì)象的生物樣品；
[0239]b)體外確定所述樣品的至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的位置和/或尺寸；
[0240]c)體外測量在a)中確定的細(xì)胞核的邊界內(nèi)的UV吸收；
[0241]d)從步驟d)中獲得的細(xì)胞核信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算所述至少一個(gè)細(xì)胞的倍性狀態(tài)，
[0242]e)基于所述倍性狀態(tài)確定癌癥的存在和/或可能未來發(fā)生癌癥。
[0243]本發(fā)明的診斷方法也包括實(shí)現(xiàn)確定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的位置和/或尺寸并確定所述細(xì)胞核的邊界內(nèi)的UV吸收的基本概念的各種實(shí)施方案。為了確定細(xì)胞核位置和/或尺寸(等同于確定細(xì)胞核的邊界)，仍舊可以使用利用可見光的相差顯微術(shù)以及利用UV光的檢測方法。為了確定細(xì)胞核的UV吸收，可以僅依賴于UV測量而不加入能夠與雙鏈核酸相互作用的熒光標(biāo)記，或者可以使用這些標(biāo)記。
[0244]在下文中，將要討論這些方法的一般方面。將要針對(duì)兩個(gè)特別的實(shí)施方案討論進(jìn)一步的問題。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解將要更詳細(xì)地討論的這兩個(gè)實(shí)施方案的某些方面可以相似地應(yīng)用于上文預(yù)料的其他實(shí)施方案。
[0245]對(duì)于步驟a)，生物樣品可以使用常規(guī)方法例如刷拭活檢、抽取、細(xì)針抽取活檢、內(nèi)窺鏡活檢等等從人或動(dòng)物對(duì)象獲得。
[0246]之后可以如上文描述的可以優(yōu)選地應(yīng)用于檢測生物樣品內(nèi)至少一個(gè)癌細(xì)胞的體外確定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核雙鏈核酸的量的方法的步驟a)和b)進(jìn)行步驟b)、c)和d)。
[0247]在上文稱為步驟e)的最后一步中，基于受檢細(xì)胞的細(xì)胞核DNA含量或倍性狀態(tài)確定癌癥的存在或可能未來發(fā)生癌癥。在介紹兩個(gè)實(shí)施方案后這個(gè)最后一步將會(huì)更加詳細(xì)地進(jìn)行討論。
[0248]當(dāng)然，上文給出的關(guān)于確定針對(duì)推斷的癌細(xì)胞的光密度圖和參考或標(biāo)準(zhǔn)的光密度圖的解釋，術(shù)語例如“體外”、“大約”、“倍性”、“非整倍性”、“近似二倍體”、“近似四倍體”、“X-倍體”、“AUC”等等的含義等同地應(yīng)用于本發(fā)明的診斷和/或預(yù)防癌癥的方法的范圍內(nèi)。
[0249]術(shù)語“體外”是指上述診斷方法的所有步驟不直接接觸所述人或動(dòng)物體而進(jìn)行。
[0250]實(shí)施方案1-診斷方法
[0251]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及診斷和/或預(yù)測人或動(dòng)物對(duì)象體內(nèi)癌癥的體外方法，所述方法包括如下步驟:
[0252]a)獲取包含來自所述對(duì)象的至少一個(gè)細(xì)胞的生物樣品；
[0253]b)體外確定所述細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的位置和/或尺寸；
[0254]c)使用UV光體外測量在b)中確定的細(xì)胞核的邊界內(nèi)的UV吸收；
[0255]d)從步驟c)中獲得的細(xì)胞核UV吸收計(jì)算所述至少一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核DNA含量或倍性狀態(tài)，以及
[0256]e)基于所述細(xì)胞核DNA含量或倍性狀態(tài)確定癌癥的存在或可能未來發(fā)生癌癥。
[0257]步驟b)和c)可以如上文描述的體外確定一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核雙鏈核酸的量的實(shí)施方案I的步驟a)和b)進(jìn)行，所述實(shí)施方案I可以優(yōu)選地進(jìn)行以檢測生物樣品中存在的至少一個(gè)癌細(xì)胞。
[0258]在本發(fā)明這些方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用波長在大約240nm和大約280nm之間的UV光在步驟a)和/或b)中測量UV吸收。特別優(yōu)選的是波長例如為大約250nm、255nm 或 260nmo
[0259]步驟d)也可以如上文描述的進(jìn)行。
[0260]在上文稱為步驟e)的最后一步中，基于受檢細(xì)胞的細(xì)胞核DNA含量或倍性狀態(tài)確定癌癥的存在或可能未來發(fā)生癌癥。
[0261]在進(jìn)行這個(gè)診斷和/或預(yù)測癌癥的方法中，可以使用相同的用于分離生物樣品、用于制備細(xì)胞樣品、用于將涉及的細(xì)胞可能地與熒光標(biāo)記接觸、用于確定信號(hào)強(qiáng)度的方法。
[0262]因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用共聚焦激光掃描顯微術(shù)鑒別細(xì)胞核的邊界和測量細(xì)胞核UV吸收。為此目的，可以使用例如上文描述的儀器。
[0263]實(shí)施方案2-診斷方法
[0264]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及診斷和/或預(yù)測人或動(dòng)物對(duì)象體內(nèi)癌癥的體外方法，所述方法包括如下步驟:
[0265]a)獲取來自所述對(duì)象的生物樣品；
[0266]b)將所述至少一個(gè)細(xì)胞與能夠與所述至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的雙鏈核酸在所述對(duì)象體外相互作用的至少一種熒光標(biāo)記接觸；
[0267]c)用通過用合適的光源激發(fā)獲得的信號(hào)確定結(jié)合至雙鏈核酸的所述至少一種熒光標(biāo)記的信號(hào)強(qiáng)度；
[0268]d)通過相差顯微術(shù)確定所述至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的位置和/或尺寸；
[0269]e)通過將c)中獲得的信號(hào)強(qiáng)度與d)中獲得的細(xì)胞核的位置和/或尺寸相關(guān)聯(lián)而確定結(jié)合至細(xì)胞核雙鏈核酸的熒光標(biāo)記的細(xì)胞核信號(hào)強(qiáng)度。
[0270]f)從步驟e)中獲得的細(xì)胞核信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算所述至少一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核DNA含量或倍性狀態(tài)
[0271]g)基于所述細(xì)胞核DNA含量或倍性狀態(tài)確定癌癥的存在或可能未來發(fā)生癌癥。
[0272]步驟b)至e)可以如上文描述的確定一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核雙鏈核酸的量的實(shí)施方案2的步驟a)至d)進(jìn)行，所述實(shí)施方案2可以優(yōu)選地進(jìn)行以檢測生物樣品中存在的至少一個(gè)癌細(xì)胞。
[0273]步驟f)也可以如上文描述的進(jìn)行。
[0274]在上文稱為步驟g)的最后一步中，基于受檢細(xì)胞的細(xì)胞核DNA含量或倍性狀態(tài)確定癌癥的存在或可能未來發(fā)生癌癥。
[0275]在進(jìn)行這個(gè)診斷和/或預(yù)測癌癥的方法中，可以使用相同的用于分離生物樣品、用于制備細(xì)胞樣品、用于將涉及的細(xì)胞與熒光標(biāo)記接觸、用于確定信號(hào)強(qiáng)度、用于如上文列出的進(jìn)行相差顯微術(shù)以進(jìn)行確定細(xì)胞核內(nèi)雙鏈核酸的量的方法的方法。
[0276]因此，所述熒光標(biāo)記可以是任何能夠與雙鏈核酸特異地相互作用并在用合適的光源激發(fā)后提供熒光信號(hào)的分子。
[0277]這些熒光標(biāo)記可以例如結(jié)合至DNA大溝或小溝。它們可以是核酸堿基嵌入劑并選自包括4’，6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)、碘化吡啶(PI)和溴化乙錠(EtBr)的一組。熒光標(biāo)記也包括SYBR green ο
[0278]本領(lǐng)域技術(shù)人員知道上文討論的步驟順序可以改變。因此可以通過首先將樣品與熒光標(biāo)記接觸并溫育開始、進(jìn)行相差顯微術(shù)以及之后確定熒光信號(hào)強(qiáng)度。在某些環(huán)境中，也可以例如首先進(jìn)行相差顯微術(shù)，之后將樣品與熒光標(biāo)記接觸并溫育，最后測量熒光信號(hào)強(qiáng)度。
[0279]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，診斷和/或預(yù)測人或動(dòng)物對(duì)象體內(nèi)癌癥的方法大體上依賴于前述步驟，步驟d)在步驟b)至c)之前，步驟c)之后進(jìn)行步驟e)、f)和g)。
[0280]診斷方法-評(píng)估
[0281]在上述方法中，在最后一步e)中(或g)，在實(shí)施方案2的情況中)，斷定癌癥可能的未來發(fā)生的存在。
[0282]癌癥診斷可以認(rèn)為是陽性的，如果針對(duì)得自所述對(duì)象的生物樣品的細(xì)胞確定的細(xì)胞核DNA含量或倍性值偏離相當(dāng)?shù)募?xì)胞類型的細(xì)胞核DNA含量或倍性值2 (和4，如果所述細(xì)胞在其健康狀態(tài)中是增殖的)至少10%的話，其中所述相當(dāng)?shù)募?xì)胞類型的細(xì)胞核信號(hào)強(qiáng)度已經(jīng)在高度相當(dāng)?shù)幕蛳嗤瑮l件下測量，并且其已知是非癌性的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述偏離至少是15%、至少是20%、至少是25%、至少是30%、至少是40%或，至少是50%。
[0283]在提示標(biāo)準(zhǔn)光密度圖的值2和4的峰的曲線下的區(qū)域(area under thecurve, AUC)被認(rèn)為提示非癌細(xì)胞，并且任何偏離預(yù)測的癌細(xì)胞的光密度圖的相應(yīng)峰的AUC至少10%被認(rèn)為提示癌細(xì)胞并因此導(dǎo)致陽性診斷。在一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方案中，所述偏離至少是15%、至少是20%、至少是25%、至少是30%、至少是40%或至少是50%。
[0284]相應(yīng)于已有實(shí)踐，如果相應(yīng)于參考光密度圖的值為2的峰的峰范圍為從1.8至2.2，可以將細(xì)胞的DNA含量稱作近似二倍體(peridiploid)。
[0285]如果相應(yīng)于參考光密度圖的值為4的峰的峰范圍為從3.6至4.4，可以將細(xì)胞的DNA含量稱作近似四倍體(peritetraploid)。
[0286]在這些范圍之外的值均被認(rèn)為是X-倍體。
[0287]為了本發(fā)明的目的，具有近似二倍體、近似四倍體和X-倍體值的細(xì)胞被認(rèn)為是癌細(xì)胞，并且相應(yīng)地，如果DNA含量被認(rèn)為是近似二倍體、近似四倍體或X-倍體，將會(huì)作出陽性癌癥診斷。
[0288]所述診斷和/或預(yù)測癌癥的體外方法可以用于診斷和/或預(yù)測選自包含白血病、淋巴瘤、腦癌、腦脊液癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、腎癌、口腔及喉癌、食管癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌和黑素瘤的一組的癌癥。
[0289]所述診斷和/或預(yù)測癌癥的方法可以用于分析選自包含骨髓細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、粘膜樣品、周圍血樣品、腦脊液樣品、尿樣品、滲出物樣品、細(xì)針抽取物、細(xì)針抽取活檢、周圍血碎肩、皮膚碎肩、脫落細(xì)胞涂片、來自體液的細(xì)胞離心制備物、細(xì)胞分離樣品(在機(jī)械和/或酶分散之后)、石蠟包埋組織和冷凍切片的一組的樣品。
[0290]在下文中，特別列出涉及上文描述的實(shí)施方案I或2的本發(fā)明的某些方面:
[0291 ] 實(shí)施方案1-某些方面
[0292]1.體外確定至少一個(gè)生物樣品中存在的至少一個(gè)細(xì)胞中的細(xì)胞核核酸的量的方法，包括如下步驟:
[0293]a)體外確定所述細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的位置和/或尺寸，
[0294]b)使用UV體外測量a)中確定的細(xì)胞核的邊界內(nèi)的UV吸收。
[0295]2.根據(jù)I的方法，其中使用UV光和/或相差顯微術(shù)確定所述至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的位置和/或尺寸。
[0296]3.根據(jù)I或2的方法，其中在步驟a)和/或b)中使用波長在大約240nm和大約280nm之間的UV光。
[029