7]4.根據(jù)3的方法，其中在步驟a)和/或b)中使用波長為大約250nm、255nm或260nm 的 UV 光。
[0298]5.根據(jù)I至4任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞核核酸未用免疫組化染色、化學(xué)反應(yīng)或焚光標(biāo)記顯色。
[0299]6.根據(jù)I至5任一項(xiàng)的方法，其中所述方法用于檢測所述至少一個(gè)生物樣品中的至少一個(gè)推斷的癌細(xì)胞的方法。
[0300]7.根據(jù)I至6任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一個(gè)細(xì)胞與選自包括白血病、淋巴瘤、腦癌、腦脊液癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、腎癌、口腔及喉癌、食管癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌和黑素瘤的一組的癌癥相關(guān)。
[0301]8.根據(jù)6的方法，其中步驟b)中的細(xì)胞核UV吸收通過將步驟b)中獲得的細(xì)胞核UV吸收與也使用權(quán)利要求1的步驟a)和b)分析的至少一個(gè)非癌細(xì)胞的細(xì)胞核UV吸收對(duì)比而用于計(jì)算推斷的癌細(xì)胞的細(xì)胞核DNA含量或細(xì)胞的倍性狀態(tài)。
[0302]9.根據(jù)8的方法，其中倍性狀態(tài)或細(xì)胞核DNA含量偏離2至少10%提示癌細(xì)胞。
[0303]10.根據(jù)8的方法，其中倍性狀態(tài)或細(xì)胞核DNA含量為1.8至2.2提示近似二倍體狀態(tài)，倍性狀態(tài)或細(xì)胞核DNA含量為3.6至4.4提示近似四倍體狀態(tài)，倍性狀態(tài)或細(xì)胞核DNA含量在這些范圍之外提示X-倍體狀態(tài)。
[0304]實(shí)施方案2-某些方面
[0305]1.確定至少一個(gè)生物樣品中存在的至少一個(gè)細(xì)胞中的細(xì)胞核雙鏈核酸的量的方法，包括如下步驟:
[0306]a)將所述至少一個(gè)細(xì)胞與至少一種能夠與所述至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的雙鏈核酸相互作用的熒光標(biāo)記接觸；
[0307]b)用通過用合適的光源激發(fā)所獲得的信號(hào)確定結(jié)合至雙鏈核酸的所述至少一種焚光標(biāo)記的信號(hào)強(qiáng)度；
[0308]c)通過相差顯微術(shù)確定所述至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的位置和/或尺寸；
[0309]d)通過將b)中獲得的信號(hào)強(qiáng)度與c)中獲得的細(xì)胞核的位置和/或尺寸相關(guān)聯(lián)而確定結(jié)合至雙鏈核酸的熒光標(biāo)記的細(xì)胞核信號(hào)強(qiáng)度。
[0310]2.根據(jù)I的方法，其中所述方法用于檢測所述至少一個(gè)生物樣品中的至少一個(gè)推斷的癌細(xì)胞。
[0311]3.根據(jù)2的方法，其中步驟d)中的細(xì)胞核信號(hào)強(qiáng)度通過將步驟d)中獲得的信號(hào)強(qiáng)度與也使用權(quán)利要求1的步驟a)至d)獲得的非癌細(xì)胞的細(xì)胞核信號(hào)強(qiáng)度對(duì)比而用于計(jì)算細(xì)胞的細(xì)胞核DNA含量或倍性狀態(tài)。
[0312]4.根據(jù)I的方法，其中倍性狀態(tài)或細(xì)胞核DNA含量偏離2或4至少10 %提示癌細(xì)胞。
[0313]5.根據(jù)4的方法，其中倍性狀態(tài)或細(xì)胞核DNA含量為1.8至2.2提示近似二倍體狀態(tài)，倍性狀態(tài)或細(xì)胞核DNA含量為3.6至4.4提示近似四倍體狀態(tài)，倍性狀態(tài)或細(xì)胞核DNA含量在這些范圍之外提示X-倍體狀態(tài)。
[0314]6.根據(jù)2的方法，其中所述至少一個(gè)癌細(xì)胞與選自包括白血病、淋巴瘤、腦癌、腦脊液癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、腎癌、口腔及喉癌、食管癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌和黑素瘤的一組的癌癥相關(guān)。
[0315]7.根據(jù)I的方法，其中所述生物樣品選自包括骨髓細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、粘膜樣品、周圍血樣品、腦脊液樣品、尿液、滲出物、細(xì)針抽取物、周圍血碎肩、皮膚碎肩、石蠟包埋組織和冷凍切片的一組。
[0316]8.根據(jù)I的方法，其中所述熒光標(biāo)記選自包括結(jié)合至DNA大溝或小溝的物質(zhì)、4’，6- 二脒-2-苯基吲哚(DAPI)、碘化吡啶(PI)和溴化乙錠(EtBr)、SYBR green、SYTOXBlue、SYTOX Green、SYTOX Orange、P0P-1、BOBO-1, YOYO-U TOTO-U JOJO-U P0P0-2、LOLO-1、BOBO-1、Y0Y0-3, T0T0-3、PO-PRO-1, BO-PRO-1, TO-PRO-1, JO-PRO-1, P0-PR0-3、LO-PRO-1、B0-PR0-3、Y0-PR0-3、T0-PR0-3、T0-PR0-5、SYTO 40 藍(lán)色熒光核酸染色劑、SYTO41藍(lán)色熒光核酸染色劑、SYTO 42藍(lán)色熒光核酸染色劑、SYTO 43藍(lán)色熒光核酸染色劑、SYTO 44藍(lán)色熒光核酸染色劑、SYTO 45藍(lán)色熒光核酸染色劑、SYTO 9綠色熒光核酸染色劑、SYTO 10綠色熒光核酸染色劑、SYTO 11綠色熒光核酸染色劑、SYTO 12綠色熒光核酸染色劑、SYTO 13綠色熒光核酸染色劑、SYTO 14綠色熒光核酸染色劑、SYTO 15綠色熒光核酸染色劑、SYTO 16綠色熒光核酸染色劑、SYTO 20綠色熒光核酸染色劑、SYTO 21綠色熒光核酸染色劑、SYTO 22綠色熒光核酸染色劑、SYTO 23綠色熒光核酸染色劑、SYTO 24綠色熒光核酸染色劑、SYT025綠色熒光核酸染色劑、SYTO 26綠色熒光核酸染色劑、SYTO 27綠色熒光核酸染色劑、SYTO BC綠色熒光核酸染色劑、SYTO 80橙色熒光核酸染色劑、SYTO 81橙色熒光核酸染色劑、SYTO 82橙色熒光核酸染色劑、SYT083橙色熒光核酸染色劑、SYTO 84橙色熒光核酸染色劑、SYTO 85橙色熒光核酸染色劑、SYTO 86橙色熒光核酸染色劑、SYTO17紅色熒光核酸染色劑、SYTO 59紅色熒光核酸染色劑、SYTO 61紅色熒光核酸染色劑、SYTO17紅色熒光核酸染色劑、SYTO 62紅色熒光核酸染色劑、SYTO 63紅色熒光核酸染色劑、SYTO 64紅色熒光核酸染色劑、卩丫啶同源二聚體、卩丫啶橙、7-AAD (7-氨基-放線菌素D)、放線菌素D、ACMA, DAP1、二氫乙錠、溴化乙錠、乙錠同源二聚體-1 (EthD-1)、乙錠同源二聚體-2(EthD-2)、Ethidium monoazide、Hexidium 1dide、Hoechst 33258(bis-benzimide)、Hoechst 33342、Hoechst 34580、Hydroxystibamidine、LDS 751 和核黃的一組。
[0317]9.根據(jù)I的方法，其中熒光標(biāo)記溴化乙錠用于檢測生物刷拭活檢樣品中的與口腔上皮癌相關(guān)的癌細(xì)胞。
[0318]10.診斷和/或預(yù)測人或動(dòng)物對(duì)象體內(nèi)癌癥的方法，包括如下步驟:
[0319]a)獲取來自所述對(duì)象的生物樣品；
[0320]b)將所述至少一個(gè)細(xì)胞與能夠與所述至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的雙鏈核酸在所述對(duì)象體外相互作用的至少一種熒光標(biāo)記接觸；
[0321]c)用通過用合適的光源激發(fā)獲得的信號(hào)確定結(jié)合至雙鏈核酸的所述至少一種熒光標(biāo)記的信號(hào)強(qiáng)度；
[0322]d)通過相差顯微術(shù)確定所述至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的位置和/或尺寸；
[0323]e)通過將c)中獲得的信號(hào)強(qiáng)度與d)中獲得的細(xì)胞核的位置和/或尺寸相關(guān)聯(lián)而確定結(jié)合至細(xì)胞核雙鏈核酸的熒光標(biāo)記的細(xì)胞核信號(hào)強(qiáng)度。
[0324]f)從步驟e)中獲得的細(xì)胞核信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算所述至少一個(gè)細(xì)胞的倍性狀態(tài)
[0325]g)基于所述倍性狀態(tài)確定癌癥的存在或可能未來發(fā)生癌癥。
[0326]在下文中，本發(fā)明根據(jù)某些實(shí)驗(yàn)實(shí)施例進(jìn)行說明。但是這些實(shí)施例不意味著將本發(fā)明限制為其范圍，而是為了通過一些示例性實(shí)施方案說明本發(fā)明。
[0327]實(shí)驗(yàn)
[0328]實(shí)驗(yàn)1-在半固定的細(xì)胞上進(jìn)行DNA成像細(xì)胞術(shù)測定
[0329]第一步中，可以例如通過刷拭活檢取樣(參見圖3)。
[0330]第二步中，從取樣刷上通過用例如生理緩沖液例如PBS pH7.4淋洗取樣單元洗脫細(xì)胞。
[0331]第三步中，可以通過添加溫和去污劑例如Triton X_100使所述細(xì)胞具有通透性而用于染色。為此目的，可以例如使用含有PBS pH 7.4,0.05% (w/v)Triton X-100的緩沖液。在(半)固定細(xì)胞方法的情況中，可以將細(xì)胞懸液加至顯微鏡載玻片上，之后干燥以進(jìn)行固定化。
[0332]在下一步中，可以例如通過用發(fā)射波長從300至600nm的LEICA EL6000光源照亮顯微鏡玻片進(jìn)行熒光測量。可以例如使用450nm光源。
[0333]通過全面掃描細(xì)胞，可以確定細(xì)胞核的位置。
[0334]之后可以使用Qimaging Retiga 2000R FASTCooled Mono 12-bit 照相機(jī)單元(www.qimaging.com)記錄細(xì)胞核UV吸收。
[0335]如果這個(gè)細(xì)胞核UV吸收與在相同條件下針對(duì)已知為非癌的細(xì)胞獲得的DNA含量相當(dāng)，那么可以計(jì)算受檢細(xì)胞的倍性狀態(tài)并確定所述細(xì)胞是否可能發(fā)展為癌癥。
[0336]實(shí)驗(yàn)2-在半固定的細(xì)胞上進(jìn)行DNA成像細(xì)胞術(shù)測定
[0337]第一步中，可以例如通過刷拭活檢取樣(參見圖3)。
[0338]第二步中，從取樣刷上通過用例如生理緩沖液例如PHS pH7.4淋洗取樣單元洗脫細(xì)胞。
[0339]第三步中，可以通過添加溫和去污劑例如Triton X-100使所述細(xì)胞具有通透性而用于染色。為此目的，可以例如使用含有PBS pH 7.4,0.05% (w/v)Triton X-100的緩沖液。在(半)固定細(xì)胞方法的情況中，可以將細(xì)胞懸液加至顯微鏡載玻片上，之后干燥以進(jìn)行固定化。
[0340]之后可以通過添加熒光嵌入染料例如溴化乙錠對(duì)細(xì)胞DNA進(jìn)行染色。由于這種以及許多其他熒光染料當(dāng)結(jié)合至DNA時(shí)具有強(qiáng)得多的熒光，因此可以不需要洗脫游離染料。然而，如果使得提高信號(hào)/背景比例，也可以進(jìn)行漂洗。
[0341]在下一步中，可以例如通過用發(fā)射波長從300至600nm的LEICA EL6000光源照亮顯微鏡玻片進(jìn)行熒光測量?？梢岳缡褂?88nm光源。(參見圖6)
[0342]之后可以使用Qimaging Retiga 2000R FASTCooled Mono 12-bit 照相機(jī)單元(www.qimaging.com)記錄發(fā)射的焚光信號(hào)。
[0343]在另一步中，同樣的樣品在相差顯微術(shù)下記錄，以鑒別所述細(xì)胞核的位置和/或尺寸(參見圖7)。
[0344]在進(jìn)一步的步驟中，合并通過熒光和相差顯微術(shù)獲得的圖像，從而只有來自于細(xì)胞核的熒光信號(hào)被記錄下來(參見圖7)。
[0345]如果這個(gè)信號(hào)與在相同條件下針對(duì)已知為非癌的細(xì)胞獲得的DNA含量相當(dāng)，那么可以計(jì)算受檢細(xì)胞的倍性狀態(tài)并確定所述細(xì)胞是否可能發(fā)展為癌癥。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.體外確定至少一個(gè)生物樣品中存在的至少一個(gè)細(xì)胞中的細(xì)胞核核酸的量的方法，包括如下步驟: a)體外確定所述細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的位置和/或尺寸， b)體外測量a)中確定的細(xì)胞核的邊界內(nèi)的UV吸收。
2.權(quán)利要求1的方法，其中使用UV光和/或相差顯微術(shù)確定所述至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的位置和/或尺寸。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中在步驟a)和/或b)中使用波長在大約240nm和大約280nm之間的UV光。
4.權(quán)利要求3的方法，其中在步驟a)和/或b)中使用波長為大約250nm、255nm或260nm 的 UV 光。
5.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一個(gè)細(xì)胞與能夠與所述至少一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的雙鏈核酸相互作用的至少一種熒光標(biāo)記接觸，并且其中用通過用合適的光源激發(fā)所獲得的信號(hào)確定結(jié)合至雙鏈核酸的所述至少一種熒光標(biāo)記的細(xì)胞核信號(hào)強(qiáng)度。
6.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞核核酸未用免疫組化染色、化學(xué)反應(yīng)或焚光標(biāo)記顯色。
7.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的方法，其中所述方法用于檢測所述至少一個(gè)生物樣品中的至少一個(gè)推斷的癌細(xì)胞的方法。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述至少一個(gè)癌細(xì)胞與選自包括白血病、淋巴瘤、腦癌、腦脊液癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、腎癌、口腔及喉癌、食管癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌和黑素瘤的一組的癌癥相關(guān)。
9.權(quán)利要求7的方法，其中通過將步驟b)中獲得的細(xì)胞核UV吸收與也使用權(quán)利要求1的步驟a)和b)分析的至少一個(gè)非癌細(xì)胞的細(xì)胞核UV吸收進(jìn)行對(duì)比，從而使用步驟b)中的細(xì)胞核UV吸收計(jì)算推斷的癌細(xì)胞的細(xì)胞核DNA含量或倍性狀態(tài)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中倍性狀態(tài)或細(xì)胞核DNA含量偏離數(shù)值2至少10%提示癌細(xì)胞。
11.權(quán)利要求9的方法，其中倍性狀態(tài)或細(xì)胞核DNA含量為1.8至2.2提示近似二倍體狀態(tài)，倍性狀態(tài)或細(xì)胞核DNA含量為3.6至4.4提示近似四倍體狀態(tài)，倍性狀態(tài)或細(xì)胞核DNA含量在這些范圍之外提示X-倍體狀態(tài)。
12.診斷和/或預(yù)測人或動(dòng)物對(duì)象體內(nèi)癌癥的方法，所述方法包括如下步驟: a)提供包含來自人或動(dòng)物對(duì)象的至少一個(gè)細(xì)胞的生物樣品； b)體外確定所述細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的位置和/或尺寸； c)體外確定在b)中確定的細(xì)胞核的邊界內(nèi)的UV吸收； d)從步驟c)中獲得的細(xì)胞核UV吸收計(jì)算所述至少一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核DNA含量或倍性狀態(tài)，以及 e)基于所述細(xì)胞核DNA含量或倍性狀態(tài)確定癌癥的存在或可能未來發(fā)生癌癥。
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用UV光進(jìn)行UV吸收測定在體外確定人或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核DNA的量的方法。本發(fā)明還涉及用于基于上述原則體外檢測生物樣品中的癌細(xì)胞的方法。本發(fā)明也涉及診斷或預(yù)測人或動(dòng)物對(duì)象體內(nèi)癌癥的可能發(fā)生的體外方法。
【IPC分類】G06T7-40, G06T7-00, G01N33-50, G01N33-574, G01N21-33, G01N33-53, G01N33-58, C12Q1-68, G01N15-14
【公開號(hào)】CN104849228
【申請?zhí)枴緾N201510127627
【發(fā)明人】B·H·W·亨德里克斯, E·R·福森納爾, G·斯佩克維爾斯, N·C·范德瓦爾特, S·凱珀
【申請人】皇家飛利浦電子股份有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2007年5月14日
【公告號(hào)】EP2038651A2, US9057729, US20090197272, WO2008001235A2, WO2008001235A3