魚腥草破壁飲片的指紋圖譜構(gòu)建及其質(zhì)量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥飲片的質(zhì)量檢測方法，尤其是魚腥草破壁飲片的HPLC指紋標(biāo)準(zhǔn) 圖譜構(gòu)建及其質(zhì)量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 魚腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜HouttuyniacordataThunb?的新鮮全草或干 燥地上部分。有效成分主要是揮發(fā)油、黃酮類和苯丙素類物質(zhì)。揮發(fā)油中功能性成分為醛 酮化合物，主要是癸酰乙醛及月桂醛，兩者均有魚腥草特異氣味。黃酮類物質(zhì)主要是槲皮 素、槲皮苷、異槲皮素、金絲桃苷、阿夫苷、瑞諾苷和蕓香苷。目前魚腥草的質(zhì)量控制研宄也 比較多，主要的研宄方法有：1、以揮發(fā)油或總黃酮為指標(biāo)控制質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。2、以GC - MS指紋 圖譜來控制魚腥草揮發(fā)油成分的質(zhì)量，以HPLC - DAD-MS指紋圖譜控制魚腥草非揮發(fā)性成 分質(zhì)量，兩者結(jié)合可較全面地控制魚腥草及其制劑的質(zhì)量。3、以指紋圖譜結(jié)合一測多評模 式控制魚腥草質(zhì)量。以何兵，劉艷等在《指紋圖譜結(jié)合一測多評模式在中藥魚腥草質(zhì)量評價(jià) 中的應(yīng)用研宄》中記載的方法為代表。但在實(shí)際操作中，魚腥草的揮發(fā)油類成份不穩(wěn)定，易 氧化聚合失效，在干制或不當(dāng)提取過程中，其有效成分會發(fā)生較大的質(zhì)和量的變化，直接影 響到藥物的療效，而黃酮、綠原酸及總的浸出物不具有專屬性，也未能系統(tǒng)，完整的反映該 藥的內(nèi)在質(zhì)量，因而不能有效的控制樣品的臨床療效。故目前的技術(shù)方法均不完善。
[0003] 中藥破壁飲片是利用現(xiàn)代超微粉碎技術(shù)將傳統(tǒng)飲片進(jìn)行破細(xì)胞壁粉碎成粒度分 布D90小于45 y m的微細(xì)顆粒，再制成30~100目的顆粒。相對于傳統(tǒng)飲片具有色澤一致， 質(zhì)量均一，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，為創(chuàng)新型中藥飲片。由于中藥破壁飲片不具傳統(tǒng)中藥飲片的形 態(tài)特征，破壁后會帶來有效成分或指標(biāo)成分等化學(xué)成分的溶出度變化，使傳統(tǒng)飲片的鑒別、 質(zhì)量檢測方法不能完全適用。發(fā)明人參照何兵，劉艷等《指紋圖譜結(jié)合一測多評模式在中藥 魚腥草質(zhì)量評價(jià)中的應(yīng)用研宄》的方法對魚腥草破壁飲片進(jìn)行檢測，但效果并不理想，此文 獻(xiàn)的方法并不適用特殊的破細(xì)胞壁飲片。此文獻(xiàn)的方法難以將魚腥草破壁飲片HPLC全譜 中的主成分峰分離開，因此，必須針對中藥破壁飲片建立專屬性強(qiáng)，全面反映中藥破壁飲片 質(zhì)量狀況的檢測方法。而建立一項(xiàng)新的質(zhì)量檢測方法并非易事，例如檢測條件、對照品的選 擇和供試品的制備方法等均需要研宄考量并進(jìn)行驗(yàn)證。雖然現(xiàn)有技術(shù)中有涉及中藥指紋圖 譜的檢測方法，但并無針對形態(tài)特殊的中藥破壁飲片的方法，且存在專屬性、穩(wěn)定性、重現(xiàn) 性和精密度差缺陷，不能完全反應(yīng)飲片的質(zhì)量情況的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為克服以上缺陷，本發(fā)明提供了一種適用于魚腥草破壁飲片的HPLC指紋標(biāo)準(zhǔn)圖 譜構(gòu)建方法，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步提供該飲片的質(zhì)量檢測方法。
[0005] 所述的魚腥草破壁飲片的標(biāo)準(zhǔn)圖譜構(gòu)建方法包括以下步驟：
[0006] (1)供試品溶液的制備：精確稱取魚腥草破壁飲片樣品約0. 500g，加入90%的甲 醇25ml，浸潤30min,超聲提取30min，用0. 22um微孔濾膜過濾備用；
[0007] ⑵對照品溶液配制：精密稱取槲皮苷對照品適量，加90%甲醇配制成約0. 16mg/ ml對照品溶液；（3)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色 譜柱，柱溫30°C，流速1. 2ml/min，檢測波長326nm，流動相A為乙腈，B為0. 1 %的磷酸溶液； 梯度洗脫：〇min-45min，乙腈變化為10% -27%，進(jìn)樣量10ul。
[0008] (4)按上述供試品溶液及對照品的制備方法和色譜條件對10批以上的魚腥草破 壁飲片樣品進(jìn)行HPLC分析，得到相應(yīng)指紋圖譜；以槲皮苷峰為參照峰，計(jì)算各指紋圖譜中 主要色譜峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積；輸入指紋圖譜分析軟件，對各批次樣品指紋圖 譜進(jìn)行相似度比較，以平均譜圖為共有模式，計(jì)算相似度，建立魚腥草破壁飲片指紋圖譜共 有模式標(biāo)準(zhǔn)圖譜如圖3所示，包括7個(gè)特征峰。
[0009] 魚腥草破壁飲片的質(zhì)量檢測方法，包括以下步驟：
[0010] (1)按上述標(biāo)準(zhǔn)圖譜構(gòu)建方法中步驟（1)和步驟（2)分別制備待測樣品供試品溶 液和對照品溶液，按步驟（3)的色譜條件，精密吸取待測樣品供試品及對照品溶液各10ul， 注入HPLC色譜儀，測定，記錄色譜，即得。
[0011] (2)合格指標(biāo)的建立及指定圖譜、判斷方法
[0012] 供試品色譜中，應(yīng)呈現(xiàn)7個(gè)與圖3-魚腥草破壁飲片HPLC指紋圖譜共有模式相對 應(yīng)的特征峰，按中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)計(jì)算，供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜 的相似度不得低于0.95。以槲皮苷峰為對照峰，其余6個(gè)共有特征峰相對保留時(shí)間分別為： 0? 196、0. 300、0. 337、0. 761、0. 788、0. 817,各峰相對保留時(shí)間 RSD 彡 ±5%，為合格品。
[0013] 本發(fā)明是首次針對魚腥草破壁飲片質(zhì)量控制所構(gòu)建的HPLC指紋圖譜共有模式標(biāo) 準(zhǔn)圖譜及質(zhì)量檢測方法。該方法克服了現(xiàn)有技術(shù)不能完全適用魚腥草破壁飲片質(zhì)量控制的 缺陷。該圖譜較全面涵蓋了魚腥草飲片主要活性成分的圖譜信息，專屬性明顯優(yōu)于現(xiàn)有的 同類指紋圖譜方法。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和精密度均達(dá)到法定要求，且操作 簡單，檢測快速準(zhǔn)確；并能有效控制魚腥草藥材、破壁粉體、破壁飲片整體質(zhì)量及鑒別偽品。
【附圖說明】
[0014] 圖1是魚腥草破壁飲片預(yù)實(shí)驗(yàn)比較圖譜。
[0015] 圖2是魚腥草破壁飲片指紋圖譜專屬性考察圖譜。
[0016] 圖3是魚腥草破壁飲片共有模式指紋圖譜。
[0017] 圖4魚腥草20140301批次原藥材-中間體-成品相關(guān)性圖譜。
[0018] 圖5是魚腥草20140302批次原藥材-中間體-成品相關(guān)性圖譜。
[0019] 圖6是魚腥草021408P081批次原藥材-中間體-成品相關(guān)性圖譜。
[0020]
【具體實(shí)施方式】
[0021] 1儀器與試樣
[0022] 1. 1儀器：電熱重蒸餾水器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）、電熱恒溫水浴 鍋HWS24(上海一恒科技有限公司、FEJ-200電子稱（d = 0. lg)、萬分之一電子天平 AB204-S(METTLERT0LE0D)、十萬分之一電子天平AUW220D(島津公司）安捷倫1200RLC快 速液相色譜儀（配有G1315C型號DAD檢測器、G4218A的ELSD蒸發(fā)光檢測器、G1312B二元 泵、G1329B自動進(jìn)樣器、G1322A脫氣機(jī)G1316B柱溫箱，Agilent Chemstation色譜工作站、 Agilent Z0RBAX-C18 5 ym(250mmX4. 6mm)、Agilent Z0RBAX-C18 1.8 ym(50mmX4. 6mm)、 菲羅門 PhenomenexSynergi 4u Fusion-RP 80A(250mmX4.6mm)色譜柱、KQ-400K0E 型高功 率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。
[0023] 1. 2試劑：乙腈（色譜純，安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司）、甲醇（色譜純，安徽 時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司）、磷酸（廣州化學(xué)試劑廠），甲醇（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）、 重蒸水（自制）。
[0024] 供試品：魚腥草破壁飲片、破壁粉體及原藥材（均由中山中智藥業(yè)集團(tuán)提供）
[0025] 對照品：槲皮苷對照品（111538-200504)、異槲皮苷對照品（111809-201001)、金 絲桃苷對照品（111521-201004)、蘆丁對照品（100080-200707)、綠原酸（110753-201314)， 均由中國食品藥品檢定研宄院提供。
[0026] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0027] 2. 1魚腥草破壁飲片預(yù)實(shí)驗(yàn)
[0028] 樣品制備：精確稱取魚腥草破壁飲片（批號20120702) 0. 5016g于50ml具 塞錐形瓶中，加入90%甲醇25ml，稱定重量，浸潤30min，超聲提?。üβ?20w，頻率 4200KHZ) 30min，取出，冷卻至室溫，用提取溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，粗濾，0. 22um微孔 濾膜過濾備用。
[0029]色譜條件 1 :Agilent Z0RBAX-C18 5 ym(250mmX4. 6mm)色譜柱，柱溫 30°C，流速 lml/min，流動相乙腈-〇? 1 %磷酸，梯度洗脫：0min-10min-35min-37min-40min,乙腈百分 比變化為：6% -8% -27% -6% -6% ;檢測波長254nm, 326nm,進(jìn)樣量10ul。（命名為參考 文獻(xiàn)5)。
[0030]色譜條件 2 :Agilent Z0RBAX-C18 5 ym(250mmX4. 6mm)色譜柱，柱溫 30°C，流速 lml/min，流動相乙腈-水，梯度洗脫：0min-60min,乙腈百分比變化為：5% -100% ;檢測波 長210nm、254nm、280nm、325nm,進(jìn)樣量10ul。（命名為基礎(chǔ)梯度）。
[0031]色譜條件 3 :Agilent Z0RBAX-C18 5 ym(250mmX4. 6mm)色譜柱，柱溫 30°C，流速 lml/min，流動相乙腈-0. 1%磷酸，梯度洗脫：0min-60min,乙腈百分比變化為：5% -100%; 檢測波長21〇11111、25411111、28〇11111、32511111，進(jìn)樣量1〇111。（命名為基礎(chǔ)梯度+01磷酸） 。
[0032]色譜條件 4 :Agilent Z0RBAX-C18 5 ym(250mmX4. 6mm)色譜柱，柱溫 20°C，流速 lml/min，流動相甲醇一0. 1 %磷酸，梯度洗脫0min-40min-50min-60min-70min,甲醇百分 比變化為：1〇% -20% -30% -10% -10% ;檢測波長320nm、325nm,進(jìn)樣量20ul。（命名為 參考文獻(xiàn)2)。
[0033]色譜條件 5 :Agilent Z0RBAX-C18 5 ym(250mmX4. 6mm)色譜柱，柱溫 20°C，流速 lml/min，流動相甲醇一0? 1 %磷酸，梯度洗脫 0min-5min-10min-20min-30min-35min-50m in,甲醇百分比變化為：30% -30% -55% -55% -95% -100% ;檢測波長 280nm、320nm,進(jìn) 樣量20ul。（命名為參考文獻(xiàn)