4)。
[0034] 以上參考文獻為內部非公開文獻，結果如圖1所示。
[0035] 由圖譜可見：色譜條件5及色譜條件4的方法重現(xiàn)性差，色譜條件1的方法在實驗 室重現(xiàn)性相對較好，且由基礎梯度分析結果可見，色譜條件1譜圖中樣品出峰數(shù)目基本完 全，于是將采用色譜條件1對魚腥草破壁飲片特征指紋圖譜進行研宄。
[0036] 2. 2魚腥草破壁飲片指紋圖譜研宄用色譜柱的初步選擇
[0037] 樣品制備：精確稱取魚腥草破壁飲片（批號20120702) 0. 5016g于50ml具 塞錐形瓶中，加入90%甲醇25ml，稱定重量，浸潤30min，超聲提?。üβ?20w，頻率 4200KHZ) 30min，取出，冷卻至室溫，用提取溶劑補足減失的重量，搖勻，粗濾，0. 22um微孔 濾膜過濾備用。
[0038] 色譜條件：采用預實驗選擇的色譜條件1分析樣品，發(fā)現(xiàn)：不同柱子分析供試品所 得譜圖效果差異不大，認為：魚腥草破壁飲片樣品對柱子適用性比較高。
[0039] 2. 3供試品制備方法考察
[0040]由于直接采用預實驗的供試品制備方法所得供試品的分析效果理想，在此，僅在 預實驗"供試品制備方法"的基礎上進行簡化、優(yōu)化，考察魚腥草破壁飲片提取液濃縮與否 對分析結果的影響。
[0041] 樣品制備：精確稱取同一批次魚腥草破壁飲片樣品，6份，①0. 5082g②0. 5031g③ 0? 5082g④0? 50831⑤0? 5068g⑥0? 5067g，分別加入90%甲醇25ml，稱定重量，浸潤30min, 超聲（320w、4200KHz)提取30min，取出，冷卻至室溫，用提取溶劑補足減失的重量，搖勻，粗 濾，①、③、⑤號，粗濾后，80°C水浴蒸干，再用90%甲醇溶解并定容至10ml，②、④、⑥號樣 品則粗濾后，用0. 22um微孔濾膜過濾備用。
[0042]色譜條件：Thermo Acclaim?C18 (4. 6X250mm，5um)色譜柱，柱溫 30 °C，流速 lml/ min，流動相，乙腈-0. 1%磷酸溶液系統(tǒng)，梯度洗脫：0min-10min-35min-37min-40min,乙腈 變化為6 % -8 % -27 % -6 % -6 %，檢測波長254nm，進樣量10ul。
[0043] 記錄圖譜，分析結果顯示：提取液濃縮與否，對魚腥草破壁飲片化學成分的種類影 響不明顯，從操作簡便考慮，選擇提取液不進行濃縮，直接用于分析。
[0044] 2. 4色譜條件優(yōu)化
[0045] 2. 4. 1洗脫梯度優(yōu)化
[0046] 樣品制備：精確稱取同一批次魚腥草破壁飲片0. 5014g于50ml具塞錐形瓶中，加 入90%甲醇25ml，稱定重量，浸潤30min，超聲提取30min，取出，冷卻至室溫，用提取溶劑 補足減失的重量，搖勻，粗濾，再用〇. 22um微孔濾膜過濾備用。
[0047]色譜條件（魚腥草梯度 1) :Thermo Acclaim? C18 (4. 6X250mm. 5um)色譜柱，柱溫 30°C，流速lml/min流動相，乙腈-0. 1 %磷酸溶液系統(tǒng)，梯度洗脫，0min-40min,乙腈變化為 8% -27%，檢測波長 254、326. 325、280nm，進樣量 10ul。
[0048]色譜條件（魚腥草梯度 2) :Thermo Acclaim? C18 (4. 6X250mm. 5um)色譜柱，柱溫 30°C，流速lml/min流動相，乙腈-0. 1 %磷酸溶液系統(tǒng)，梯度洗脫，0min-40min,乙腈變化為 10% -27%，檢測波長 254、326. 325、280nm，進樣量 10ul。
[0049]色譜條件（魚腥草梯度 3) :Thermo Acclaim? C18 (4. 6X250mm. 5um)色譜柱，柱溫 30°C，流速lml/min流動相，乙腈-0. 1 %磷酸溶液系統(tǒng)，梯度洗脫，0min-45min,乙腈變化為 8% -27%，檢測波長 254、326. 325、280nm，進樣量 10ul。
[0050] 結果：通過分析魚腥草破壁飲片梯度1至梯度3的實驗數(shù)據(jù)得出，將洗脫系統(tǒng)中乙 腈的起始濃度提高，降低變化速率，能提高分離度，出峰時間提前，譜圖的整體效果改善。選 擇魚腥草梯度3作為洗脫條件。
[0051] 2. 4. 2洗脫流速考察
[0052] 樣品制備：精確稱取同一批次魚腥草破壁飲片0. 5014g于50ml具塞錐形瓶中，加 入90%甲醇25ml，稱定重量，浸潤30min，超聲提取30min，取出，冷卻至室溫，用提取溶劑 補足減失的重量，搖勻，粗濾，再用〇. 22um微孔濾膜過濾備用。
[0053]色譜條件：Thermo Acclaim? C18 (4. 6X250mm. 5um)色譜柱，柱溫 30°C，流動相為 乙腈-0. 1%磷酸溶液系統(tǒng)，梯度洗脫，0min-45min，乙腈變化為8% -27%，檢測波長254、 326、325、28〇11111，進樣量1〇111。分別考察流速為0.61111/111；[11、0.81111/111；[11、1.01111/111；[11、1.21111/ min的分析效果。
[0054] 將上述測得的4張譜圖導入中智指紋圖譜分析軟件分析圖顯示，流速減慢，分離 度增加但是峰形變差；流速提高，峰形瘦高且樣品洗脫較完全，1. 2ml/min譜圖的分離度已 經(jīng)達到要求，因此選擇1. 2ml/min作為最佳流速。
[0055] 2. 5魚腥草破壁飲片特征指紋圖譜分析方法確定
[0056] 樣品制備：精確稱取魚腥草破壁飲片約0. 50g，于50ml具塞錐形瓶中，加入90%甲 醇25ml，稱定重量，浸潤30min，超聲提取30min，取出，冷卻至室溫，用提取溶劑補足減失的 重量，搖勻，粗濾，再用〇. 22um微孔濾膜過濾備用。
[0057] 色譜條件：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，流速1. 2ml/min，柱溫30°C，流動相為乙 腈-〇.1%磷酸溶液系統(tǒng)，梯度洗脫，〇1^11-451^11，乙腈變化為8%-27%，檢測波長32611111，進 樣量 10ul，流速 1. 2ml/min。
[0058] 2. 6魚腥草破壁飲片方法學考察
[0059] 參照《中藥注射劑指紋圖譜研宄的技術指南（試行）》，對魚腥草破壁飲片指紋圖 譜分析方法進行方法學考察。
[0060] 2. 6. 1專屬性
[0061] 考察此方法建立的魚腥草破壁飲片指紋圖譜是否能夠表達該品種的特征，不受其 他的影響，即唯一性。考察空白溶劑圖譜（陰性樣品圖譜）在相應保留時間處有無色譜峰， 有無干擾，是否符合要求。
[0062] 結果如圖2所示：通過譜圖我們得出空白溶劑圖譜在相應保留時間處無色譜峰， 無干擾，符合指紋圖譜質量控制技術的要求。
[0063] 2. 6. 2儀器精密度考察
[0064] 取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄指紋圖譜，計算6次進樣所得指紋圖譜的 各主要色譜峰的峰面積及相對峰面積RSD及所得指紋圖譜的相似度。結果如表1所示：6 譜圖的相似度〇. 9996以上，主要色譜峰的峰面積及相對峰面積RSD均小于5%，符合中藥注 射劑指紋圖譜技術要求。
[0065] 表1-1魚腥草破壁飲片精密度相似度表
[0066]
【主權項】
1. 魚腥草破壁飲片的HPLC指紋圖譜共有模式標準圖譜的構建方法，其特征在于，包括 以下步驟： (1) 供試品溶液的制備：精確稱取魚腥草破壁飲片樣品約0. 500g，加入90%的甲醇 25ml，浸潤30min,超聲提取30min，用0. 22um微孔濾膜過濾備用； (2) 對照品溶液配制：精密稱取槲皮苷對照品適量，加90%甲醇配制成約0. 16mg/ml對 照品溶液；（3)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱， 柱溫30°C，流速I. 2ml/min，檢測波長326nm，流動相A為乙腈，B為0. 1 %的磷酸溶液；梯度 洗脫：0min-45min，乙腈變化為10% -27%，進樣量10ul。 (4)按上述供試品溶液及對照品的制備方法及和色譜條件對10批以上的魚腥草破壁 飲片樣品進行HPLC分析，得到相應指紋圖譜；以槲皮苷峰為參照峰，計算各指紋圖譜中主 要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積；輸入指紋圖譜分析軟件，對各批次樣品指紋圖譜 進行相似度比較，以平均譜圖為共有模式，計算相似度，建立魚腥草破壁飲片指紋圖譜共有 模式標準圖譜，包括7個特征峰。
2. -種魚腥草破壁飲片的質量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 按權利要求1所述的構建方法中步驟（1)和步驟（2)分別制備待測樣品供試品溶 液和對照品溶液，按步驟（3)的色譜條件，精密吸取待測樣品供試品及對照品溶液各10ul， 注入HPLC色譜儀，測定，記錄色譜，即得。 (2) 合格指標的建立及指定圖譜、判斷方法 供試品色譜中，應呈現(xiàn)7個與圖3-魚腥草破壁飲片HPLC指紋圖譜共有模式相對應 的特征峰，按中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)計算，供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜的 相似度不得低于〇. 95。以槲皮苷峰為對照峰，其余6個共有特征峰相對保留時間分別為： 0? 196、0. 300、0. 337、0. 761、0. 788、0. 817,各峰相對保留時間 RSD 彡 ±5%，為合格品。
【專利摘要】本發(fā)明涉及魚腥草破壁飲片的指紋圖譜共有模式構建及其質量檢測方法。該方法以槲皮苷為對照，在柱溫30℃，326nm波長，乙腈為流動相A，0.1％的磷酸溶液為流動相B，洗脫梯度0min-45min，流動相A變化10％-27％的色譜條件下，對10批以上樣品進行HPLC分析，建立共有模式標準圖譜和判斷指標。將同一色譜條件下的待測樣品圖譜與之比較，檢測待測樣品的質量。本發(fā)明是首次針對魚腥草破壁飲片建立的HPLC共有模式標準圖譜及質量檢測方法。該圖譜較全面涵蓋了魚腥草破壁飲片主要活性成分的圖譜信息，專屬性強，檢測快速準確；并能有效控制藥材、破壁粉體、破壁飲片的整體質量。
【IPC分類】G01N30-02
【公開號】CN104849363
【申請?zhí)枴緾N201510116375
【發(fā)明人】彭麗華, 王慧玲, 徐吉銀, 成金樂
【申請人】中山市中智藥業(yè)集團有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年3月17日