一種從牡蠣中提取腹瀉性貝毒素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種腹瀉性貝毒素的提取方法，具體設(shè)及一種從 牡頗中提取腹瀉性貝毒素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腹瀉性貝毒素（diarrhetic化ellfish化isoning，DSF0是由赤潮藻類罐藻屬和 原甲藻屬的一些種類產(chǎn)生的脂溶性多環(huán)離類生物活性物質(zhì)。DSP可引起食用者腹瀉、嘔吐， 通常數(shù)日內(nèi)癥狀消失，患者可自愈。DSP在我國(guó)沿海經(jīng)常出現(xiàn)，也是世界各國(guó)監(jiān)控的主要毒 素種類之一。無(wú)論是毒素進(jìn)行可靠的檢測(cè)和分析，還是開(kāi)發(fā)新的毒素檢測(cè)分析技術(shù)，尤其是 制度毒素快速檢測(cè)試劑盒，都必須使用大量的毒素標(biāo)準(zhǔn)品。
[0003] 在中國(guó)引發(fā)腹瀉性貝毒的藻類有；漸尖罐藻值inophysisacuminata)、具尾 罐藻值1州ta)、倒卵形罐藻值Ifortii)、底層原甲藻（Prorocentrumlima)、Dlmitra、 Dlnovegica、Dlsac州lus和Dltropos等。罐藻的細(xì)胞側(cè)扁，大致呈楠圓型，橫溝明顯，在細(xì) 胞前部，縱溝短?？v溝、橫溝處有類似魚(yú)罐的邊翅，橫溝處的扁翅為漏斗狀。細(xì)胞長(zhǎng)40~ llOLm，寬30~lOOLm，它的很多種類能產(chǎn)生腹瀉性貝毒。此類甲藻在中國(guó)南海常年有分 布。在貝類、魚(yú)類和其他動(dòng)物的濾食或攝食過(guò)程中，海水中產(chǎn)生腹瀉性貝毒的藻類作為食 物轉(zhuǎn)移到它們的胃或食道中，經(jīng)胃和腸消化、吸收并導(dǎo)致DSP在貝體內(nèi)的積累。積累該類 毒素的貝類有牡頗、日本巧孔扇貝、凹線始蝴、沙海卿、紫貽貝、鳳螺和錦始等。貝毒素危害 具有突發(fā)性和廣泛性，由于其毒性大、反應(yīng)快、無(wú)適宜解毒劑，給防止帶來(lái)了許多困難，因 此，對(duì)貝毒素的研究及制備為確保水產(chǎn)品及人類生命財(cái)產(chǎn)安全具有重要意義。此外，貝毒 素比眼鏡蛇毒素高80倍，比一般麻醉劑，如可卡因還強(qiáng)10萬(wàn)多倍[參見(jiàn)；金傳蔭，何家 斃，朱家明等.水華束絲藻NH-5株產(chǎn)生麻搏性貝毒素幾個(gè)相關(guān)問(wèn)題的研究.水生生物學(xué) 報(bào)，2000, 24(1) :94-96.]?？蒞通過(guò)對(duì)貝毒素中的關(guān)鍵組份的衍生物進(jìn)行合成研究，探索出 醫(yī)藥或農(nóng)藥的先導(dǎo)化合物。
[0004] 當(dāng)前國(guó)內(nèi)從貝類中提取DSP的研究都處于小試階段，提取率低下，且還沒(méi)有從牡 頗中提取DSP的批量生產(chǎn)制備技術(shù)，此外，牡頗為資源豐富的海洋生物之一，為了提高牡頗 的生物利用價(jià)值，探索出應(yīng)用價(jià)值極高的DSP的生產(chǎn)技術(shù)方法十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種從牡頗中提取DSP的方法，該方法技術(shù)合理簡(jiǎn)便，可W 工業(yè)化批量生產(chǎn)。本發(fā)明技術(shù)可W從資源豐富、經(jīng)濟(jì)廉價(jià)的海洋生物牡頗中大量提取DSP， 不僅提高了牡頗的使用價(jià)值，還經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的批量生產(chǎn)出高純度DSP產(chǎn)品；從牡頗中所提取 的DSP雜質(zhì)較少，通過(guò)進(jìn)一步分離、純化可得到高純度DSP產(chǎn)品，方法技術(shù)簡(jiǎn)單、有效。
[0006] 本發(fā)明采用如下技術(shù)方案；
[0007] -種從牡頗中提取腹瀉性貝毒素的方法，具體步驟如下：
[0008] (1)將牡頗置于冰箱中冷凍，使其均掛有冰衣；所述的牡頗是指去殼后的干凈新 鮮牡頗肉，所述的牡頗肉獲取方法是：用清水徹底洗凈牡頗外殼，切斷閉殼肌，用清水淋洗 內(nèi)部去除泥沙及其它異物，嚴(yán)謹(jǐn)W加熱或藥物方法開(kāi)殼取肉；
[000引 似取一定質(zhì)量冷凍過(guò)的牡頗，解凍，加入（0. 1~0. ^ml/g的丙酬（按牡頗原始 質(zhì)量計(jì)算，下同），置于組織搗碎勻漿機(jī)中勻漿巧~l0)min，倒入杯中；
[0010] (3)再向上述含有勻漿的杯中加入（2. 0~3. 5)ml/g的丙酬，用玻璃椿攬拌均勻， 再將勻漿移入組織搗碎勻漿機(jī)中進(jìn)行勻質(zhì)，在（3000~6000)r/min的轉(zhuǎn)速下勻質(zhì)巧~10) min,再移入布氏漏斗中抽濾，得到暗綠色澄清液體Ml;
[0011] (4)將濾出物加入（2~4. 5)ml/g的丙酬，移入組織搗碎勻漿機(jī)中進(jìn)行勻質(zhì)，在 (4000~7000)r/min的轉(zhuǎn)速下勻質(zhì)巧~10)min,再移入布氏漏斗中抽濾得深褐色澄清液 體M2;重復(fù)此操作1次，抽濾得深褐色液體Ms;
[001引 妨合并上述抽濾液Ml、M2及Ms,移入圓底燒瓶中搖勻，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)澄清抽濾 液進(jìn)行減壓濃縮，壓力為；-(0. 6~0. 8)kpa，溫度為；（30~60) °C，直至體積不再減少，液 面不再有氣泡；
[001引 做加入（1.0~3.Wml/g的己離到圓底燒瓶中搖勻，移入分液漏斗中，再用 (0. 2~0. 8)ml/g的己離再次沖洗圓底燒瓶，倒入分液漏斗中，輕輕震蕩，靜置分層取下層 溶液；
[0014] (7)將蒸饋水倒入下層溶液，蒸饋水的用量為己離質(zhì)量的（0.4~0.6)，輕輕震蕩， 靜置分層，除去下層的水層；重復(fù)上述操作1次；
[00巧]做將上層深褐色清液移入圓底燒瓶中減壓蒸饋，進(jìn)行濃縮，盡量蒸出己離，待瓶 內(nèi)無(wú)氣泡產(chǎn)生，體積不再減少時(shí)停止蒸饋濃縮，最后得到的濃縮液即是目標(biāo)產(chǎn)品DSP粗品；
[0016] 進(jìn)一步，將本發(fā)明所研制的DSP粗品通過(guò)中壓層析柱進(jìn)行分離純化，制備出高純 度的DSP樣品，具體技術(shù)方案如下：
[0017] (9)裝柱；將粒度為（100~400)目的硅膠裝于規(guī)格為；（2~20)X(20~100)cm 的中壓層析柱中，輕輕敲打?qū)游鲋谑构枘z排列緊密，然后加入約（1~3)cm的石英砂，裝 上柱頭；
[001引 （10)淋洗；用石油離、己酸己醋、氯仿、甲醇、丙酬、己離等有機(jī)溶劑中一種或任； 種的混合溶劑作為淋洗液，并將淋洗液潤(rùn)濕柱內(nèi)填充料，并用蠕動(dòng)累W化~8)rpm的壓力 平衡柱子，（40~80)min后緩慢減壓，W防止填充硅膠出現(xiàn)斷層，停止淋洗；
[001引 （11)加樣；取樣品，用（3.0~8. 0)ml/g的石油離稀釋（使樣品易于透過(guò)柱內(nèi)填 充料），得均勻的班巧色略顯粘稠液體。取下柱頭于加入樣品，待樣品完全進(jìn)入硅膠后，裝上 柱頭，用蠕動(dòng)累加壓化~9)rpm過(guò)柱，可觀察到樣品的不同組分沿著柱體分離；
[0020] 【注】加樣時(shí)避免將樣品沾在柱內(nèi)壁上，也不要讓硅膠面變干，裝柱時(shí)盡量壓緊并 保證均勻，W防止樣品在過(guò)柱時(shí)分層和拖尾現(xiàn)象，并隨時(shí)檢查柱的密封情況；
[0021] (12)接收組分：樣品過(guò)柱（2~5)個(gè)小時(shí)后，分兩次接收組分，第一次接收的組分 為目標(biāo)組分記為組分1，第二次接收組分記為組分2 ;
[0022] (13)濃縮；將組分1與組分2分別移入圓底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮條 件；壓力為；-(〇. 6~0. 8)kpa，溫度為；（30~60)°C;組分1經(jīng)過(guò)濃縮后即得到較純的DSP 樣品1，組分2濃縮后得到產(chǎn)品2。
[0023] 進(jìn)一步，本發(fā)明將粗品過(guò)柱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、過(guò)短，及過(guò)柱后的柱內(nèi)液體分別取樣，減壓 濃縮制備得到相應(yīng)的產(chǎn)品。具體技術(shù)方案如下：
[0024] (14)重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟（9)至（11)，（0. 5~1. 0)h接收兩種組分，記為組分3、 4,再將下半部分硅膠從柱中倒出，依次用（1.0~2. 0)ml/g的己離、甲醇、丙酬、石油離、 己酸己醋及氯仿中一種或任S種的混合溶液，萃取兩次，得組分5 ;將上半部分硅膠從層 析柱中倒出，依次用（1.0~2. 0)ml/g己離、甲醇、丙酬、石油離、己酸己醋及氯仿中一種 或任S種的混合溶劑，萃取兩次，得組分6 ;分別將組分3、4、5、6移入圓底燒瓶中，在壓力 為；-(0. 6~0. 8)kpa，溫度為；（30~60) °C的條件下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，分別得到產(chǎn) 品 3、4、5、6。
[002引（巧）重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟（9)至（11)，化~10化后開(kāi)始分離接收組分，分別用己 離、甲醇、丙酬、石油離、己酸己醋及氯仿中一種或任=種混合溶劑洗脫出組分7,黃色，柱 內(nèi)剩余少量細(xì)絲狀拖尾；用石油離