：己酸己醋：甲醇=(22~26) : (2~6) : (1. 0~2. 0) 的淋洗夜洗脫出組分8,黃色；組分9,接近于無色；用石油離：己酸己醋：甲醇=(22~ 26) : (2~6) : (1. 0~2. 0)的淋洗夜洗脫出組分10,黑色；組分11，褐色；組分12,灰綠色； 最后的余尾組分13 ;將柱內(nèi)硅膠倒出，依次用己離、甲醇、丙酬、石油離、己酸己醋及氯仿中 一種或任S種混合溶劑的（2. 0~5. 0)ml/g，萃取兩次，得組分14。將W上8個(gè)組分：組分 7、8、9、10、11、12、13、14分別減壓濃縮，濃縮條件見表1，最后得到產(chǎn)品7、8、9、10、11、12、 13、14。
[0026] 表1各組分的濃縮條件
[0027]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種從牡蠣中提取腹瀉性貝毒素的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將牡蠣置于冰箱中冷凍，使其均掛有冰衣； (2) 取一定質(zhì)量冷凍過的牡嫩，解凍，加入（0. 1-0. 2) ml/g的丙酮(按牡嫩原始質(zhì)量計(jì) 算，下同)，置于組織搗碎勻漿機(jī)中勻漿（5-10) min，移入燒杯中； (3) 再向上述含有勻漿的燒杯中加入（2. 0-3. 5) ml/g的丙酮，用玻璃棒攪拌均勻，再將 勾衆(zhòng)移入組織搗碎勾衆(zhòng)機(jī)中進(jìn)行勾質(zhì)，在（3000-6000)r/min的轉(zhuǎn)速下勾質(zhì)（5-8)min，再移 入布氏漏斗中抽濾，得到暗綠色澄清液體M 1; (4) 將濾出物加入（2-4. 5) ml/g的丙酮，移入組織搗碎勻漿機(jī)中進(jìn)行勻質(zhì)，在 (4000-7000)r/min的轉(zhuǎn)速下勻質(zhì)（5-10)min，再移入布氏漏斗中抽濾得深褐色澄清液體M 2; 重復(fù)此操作，抽濾得深褐色液體M3; (5) 合并上述抽濾液Mn 112及M3，移入圓底燒瓶中搖勻，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對澄清抽濾液進(jìn) 行減壓濃縮，壓力為-(0.6-0. 8) kpa，溫度為（30-60) °C，直至體積不再減少，液面不再有 氣泡； (6) 加入（1. 0-3. 5) ml/g的乙醚到圓底燒瓶中搖勻，移入分液漏斗中，再用（0. 2-0. 8) ml/g的乙醚再次沖洗圓底燒瓶，移入分液漏斗中，輕輕震蕩，靜置分層取下層溶液； (7) 將蒸餾水倒入下層溶液，蒸餾水的用量為乙醚質(zhì)量的（0. 4-0. 6)，輕輕震蕩，靜置分 層，除去下層的水層；重復(fù)上述操作1次； (8) 將上層深褐色清液移入圓底燒瓶中減壓濃縮，減壓濃縮條件為：壓力 為：-(0.5-0. 9) kpa，溫度為：（30-60) °C;盡量蒸出乙醚，待瓶內(nèi)無氣泡產(chǎn)生，體積不再減 少時(shí)停止；最后得到的濃縮液即是目標(biāo)廣品DSP粗品 (9) 將DSP粗品通過中壓層析柱分離純化，得到高純度的DSP。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中所述的牡蠣是指：去殼 后的干凈新鮮牡蠣肉，所述的牡蠣肉獲取方法是：用清水徹底洗凈牡蠣外殼，切斷閉殼肌， 用清水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其它異物，嚴(yán)謹(jǐn)以加熱或藥物方法開殼取肉；步驟（2)中的所 述的丙酮用量優(yōu)選為：（〇. 12-0. 15) ml/g，所述的在組織搗碎勻漿機(jī)中勻漿轉(zhuǎn)速優(yōu)選為： (3000-4000) r/min，所述的勾質(zhì)時(shí)間優(yōu)選為：（6-8) min ;步驟（3)中所述的丙酮加入量優(yōu) 選為：（2-2. 5) ml/g，所述的在組織搗碎勻漿機(jī)中勻漿轉(zhuǎn)速優(yōu)選為：（3500-4500) r/min，所 述的勾質(zhì)時(shí)間優(yōu)選為：（6-9) min ;步驟（4)中所述的丙酮加入量優(yōu)選為：（2. 0-2. 5) ml/g， 所述的在組織搗碎勾衆(zhòng)機(jī)中勾衆(zhòng)轉(zhuǎn)速優(yōu)選為：（4500-5500) r/min，所述的勾質(zhì)時(shí)間優(yōu)選 為：（6-9)min ;步驟（5)中所述的減壓濃縮條件優(yōu)選為：壓力為：-(0. 6-0. 7)kpa，溫度為： (30-50) °C;步驟（6)中所述的乙醚添加量優(yōu)選為：（1. 2-2. 5)ml/g，所述的清洗用乙醚的 添加量優(yōu)選為：4-0. 6)ml/g;步驟（7)中所述的蒸餾水用量優(yōu)選為乙醚質(zhì)量的0. 4-0. 6; 步驟（8)中所述的減壓蒸餾的條件優(yōu)選為：壓力為：-(0.6-0.8)kpa，溫度為：（30-45) °C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1至2任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，在權(quán)利要求1的步驟（9) 中所述的DSP粗品的分離純化方法如下： (A)裝柱：將粒度為（100-400)目的硅膠裝于規(guī)格為：（2-20) X (20-100)cm的中壓層 析柱中，輕輕敲打?qū)游鲋谑构枘z排列緊密，然后加入約（1-3) cm的石英砂，裝上柱頭； (B) 淋洗：用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑中一種或任三種的混 合溶劑作為淋洗液，將淋洗液潤濕柱內(nèi)填充料，并用蠕動(dòng)泵以（6-8) rpm的壓力平衡柱子， (40-80) min后緩慢減壓，以防止填充硅膠出現(xiàn)斷層，停止淋洗； (C) 加樣：取樣品，用（3. 0-8.0) ml/g的石油醚稀釋(使樣品易于透過柱內(nèi)填充料)，得 均勻的琥珀色略顯粘稠液體；取下柱頭于加入樣品，待樣品完全進(jìn)入硅膠后，裝上柱頭，用 蠕動(dòng)泵加壓（6-9) rpm過柱，可觀察到樣品的不同組分沿著柱體分離； (D) 接收組分及濃縮：（2-5) h后，接收組分；將組分移入圓底燒瓶，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓 濃縮，壓力為：-(〇.6_〇. 8)1^&，溫度為：（3〇-6〇)°〇 。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，在步驟(A)中所述的中壓層析柱規(guī) 格優(yōu)選為：（2-8) X (30-60) cm;填料優(yōu)選為：（100-200)目的硅膠及頂部（1-2) cm的石英 砂。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟（B)中所述的淋洗液優(yōu)選為：石 油醚、乙酸乙酯及甲醇的混合溶液；其中淋洗液各組分的體積比優(yōu)選為：石油醚：乙酸乙 酯：甲醇=(22-26) : (2-6) : (1-2)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法中，其特征在于，所述的淋洗液優(yōu)選為：石油醚：乙酸乙 酯：甲醇=(23-24) : (3-5) : (1-2)，以石油醚：乙酸乙酯：甲醇=24:4:1為最優(yōu)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟（C)中所述的蠕動(dòng)泵壓力優(yōu)選為 (6. 5-7. 5)rpm，所述的減壓淋洗時(shí)間優(yōu)選為：（6-8)min ;所述的層析柱中加入樣品后，懦動(dòng) 泵的壓力優(yōu)選為：（6. 5-7. 5) rpm。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟（D)所述接收組分的減壓濃縮條 件優(yōu)選為：壓力為：-(〇.65-〇. 75)1^&，溫度為：（35-5〇)°〇 。
9. 一種根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的制備方法提取的腹瀉性貝毒素。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從牡蠣中提取腹瀉性貝毒素的方法。所述提取方法包括：（1）將去殼牡蠣置于冰箱中；（2）取掛有冰衣的牡蠣解凍，加入丙酮進(jìn)行勻漿；（3）再次加入丙酮?jiǎng)蛸|(zhì)后抽濾。（4）將濾出物加入丙酮?jiǎng)蛸|(zhì)后抽濾；重復(fù)此操作，最后得深褐色液體；（5）合并上述抽濾液，減壓濃縮；（6）向濃縮液中加入乙醚，搖勻后移入分液漏斗，靜置分層后取下層溶液；（7）用蒸餾水進(jìn)行水洗下層溶液，靜置分層，除去下層的水層；（8）將上層清液減壓濃縮，最后得到腹瀉性貝毒素粗品。（9）使用中壓層析柱分離純化，得到高純度腹瀉性貝毒素。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明從牡蠣中提取制備大批量的腹瀉性貝毒素，方法簡單、有效，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【IPC分類】C07G99-00, G01N1-28
【公開號】CN104880343
【申請?zhí)枴緾N201510176440
【發(fā)明人】高秀巖, 徐文娟, 王希娣, 姜國勝
【申請人】煙臺海安藥物研發(fā)有限公司
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年4月15日