付之鱟試驗的抗凝血酶iii用的前處理劑及前處理方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及付之使用了整試劑的內(nèi)毒素等祀標物質(zhì)的檢測試驗的抗凝血酶III 用的前處理劑和包含該處理劑的整試劑盒、W及使用了它們的抗凝血酶III的前處理方法 和使用了整試劑的內(nèi)毒素等祀標物質(zhì)的測定方法。
[0002] 本發(fā)明中，有時使用下述簡稱。
[0003] Et;內(nèi)毒素
[0004] BG;(1 - ：3)-e-D-葡聚糖
[0005] ATIII;抗凝血酶III
【背景技術】
[0006] 內(nèi)毒素是存在于革蘭氏陰性細菌的細胞壁外膜上的脂多糖，且己知是強致熱原。 此外，己知的是，除了發(fā)熱W外，內(nèi)毒素還會引起休克癥狀等各種病狀。因此，從確保醫(yī)藥品 等的安全性的觀點出發(fā)，注射劑等醫(yī)藥品、水、醫(yī)療器具等中的內(nèi)毒素的檢測、定量很重要。
[0007] 己知的是，若革蘭氏陰性細菌感染整，則會引起血液凝固，該現(xiàn)象被用于內(nèi)毒素的 檢測。目P，可W使用整血細胞提取液（整的變形細胞溶解物，下文中也稱為"LAL")測定內(nèi) 毒素。該被稱為整試驗，利用存在于LAL中的各種蛋白質(zhì)（均為絲氨酸蛋白酶）的級聯(lián)反 應，該反應是通過內(nèi)毒素與LAL接觸而發(fā)生的。
[000引ATIII為血液中的抗凝血因子，被用于彌散性血管內(nèi)凝血值1C)等的治療。此處， 由于ATin為絲氨酸蛋白酶抑制劑，因此可抑制參與存在于LAL中的級聯(lián)反應的蛋白質(zhì)的 活性（非專利文獻1)。該樣，有時通過待測試樣而顯示出對于整試劑的抑制作用。該種抑 制作用有時可通過待測試樣的稀釋來避免（非專利文獻2)。但是，ATIII對于整試劑的抑 制作用極強，為了將ATIII制劑（注射劑）付之整試驗，需要稀釋64倍W上（非專利文獻 2)。由此，若考慮整試劑的檢測靈敏度（校準曲線的最小內(nèi)毒素濃度），則認為難W將整試 驗適用于ATIII制劑（非專利文獻2)。實際上，關于包含ATIII的試樣，現(xiàn)在也利用兔發(fā)熱 試驗進行內(nèi)毒素的檢測（非專利文獻1)。
[0009] 非專利文獻1中公開了一種測定ATIII制劑的化的方法，其特征在于，將ATIII 制劑稀釋100倍，在70°c加熱20分鐘進行前處理后，與LAL反應，通過光散射法進行測定。 該方法的技術特征在于，為了使Et的檢測高靈敏度化，代替使用分光光度計的比濁法而采 用了使用光散射測定裝置的光散射法。但是，該方法與上述同樣地必須進行高倍率的稀釋， 而且至少還存在W下的問題。
[0010] (1)作為整試驗的測定裝置而廣泛普及的是分光光度計，為了實施光散射法而需 要另行新導入、使用光散射測定裝置。
[0011] (2)在日本藥典中，作為化的光學定量法僅規(guī)定了比濁法和比色法，未規(guī)定光散 射法。
[0012] 另外，在專利文獻1中記載了下述生物體來源的試樣的化及BG的測定方法，其特 征在于，使生物體來源的試樣與堿±金屬硫酸鹽或堿±金屬面化物接觸，加熱進行前處理 后，付之使用整試劑的測定。
[0013] 另外，在專利文獻2中記載了下述血液來源的試樣的化及BG的測定方法，其特征 在于，將生物體來源的試樣與海地美錠化exadimet虹ine)化合物、堿金屬氨氧化物、非離 子性表面活性劑及堿±金屬面化物混合，加熱進行前處理后，付之使用整試劑的測定。
[0014] 另外，在專利文獻3中記載了下述有可能含有ATIII的試樣的化測定方法，其特 征在于，使生物體來源的試樣與固定有脂多糖和/或脂質(zhì)A結合膚的載體接觸，吸附回收Et 后，付之使用整試劑等的測定。
[0015] 但是，在所有文獻中均未有關于下述內(nèi)容的記載：為了實施ATIII的整試驗，在與 二價金屬鹽共存的狀態(tài)下，將ATIII供至使蛋白質(zhì)失活的處理中，進行前處理。
[0016] 現(xiàn)有技術文獻
[0017] 專利文獻
[0018] 專利文獻1 ;國際公開2006/080448號小冊子
[0019] 專利文獻2 ;日本特開平6-70796
[0020] 專利文獻3 ;日本特開2010-243342
[0021] 非專利文獻
[0022] 非專利文獻1;內(nèi)毒素?自然免疫研究15-飛躍的自然免疫研究一(工シFh豐 シシ?自然免疫研究15-飛躍子吝自然免疫研究一)、醫(yī)學圖書出版、P. 27~30、2012
[0023] 非專利文獻2;內(nèi)毒素研究12-自然免疫學的新展開一(工シFh豐シシ研究 12-自然免疫學①新t在展開一）、醫(yī)學圖書出版、P.93~97、2009

【發(fā)明內(nèi)容】

[0024] 發(fā)巧要解決的間願
[0025] 本發(fā)明的課題在于提供一種手段，其可減少將ATIII付之整試驗時的反應干擾作 用，因此可高精度地實施ATIII的整試驗。此處所說的"反應干擾作用"是指，由于整試驗 的測定對象物質(zhì)巧t、BG等）W外的因素引起、并且對整試驗的結果產(chǎn)生影響的所有作用。 因此，"反應干擾作用"例如包括;ATIII本身、與ATIII共存的添加物或雜質(zhì)等成分、在前處 理時共存的前處理劑W外的試劑等成分、和/或整試劑中的成分等所引起的、該些成分自 身不溶化的作用、促進或抑制整試劑的反應的作用、改變Et的膠束結構或BG的高級結構而 使它們的活性（對于整試劑中的C因子或G因子的反應性）發(fā)生變化的作用等對整試驗的 結果產(chǎn)生影響的所有作用。
[00%] 用于解決間願的方秦
[0027] 本發(fā)明人為了解決上述課題進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)，在與二價金屬鹽共存的 狀態(tài)下，將ATIII付之熱處理或酸處理等使蛋白質(zhì)失活的處理中，由此能夠降低將ATIII付 之整試驗時的反應干擾作用，從而能夠高精度地實施ATIII的整試驗，由此完成了本發(fā)明。 [002引 即，本發(fā)明包括W下的方案。
[0029] 山
[0030] 一種前處理劑，其為付之整試驗的抗凝血酶III用的前處理劑，
[0031] 該前處理劑含有二價金屬鹽，
[0032] 該前處理劑用于在將抗凝血酶III付之整試驗前，在與上述前處理劑共存的狀態(tài) 下，將該抗凝血酶III供至使蛋白質(zhì)失活的處理中。
[0033] [2]
[0034] 上述前處理劑，其中，上述二價金屬鹽為選自由二價金屬氯化物、二價金屬己酸鹽 及二價金屬硫酸鹽組成的組中的一種或一種W上的金屬鹽。
[0035] [3]
[0036] 上述前處理劑，其中，構成上述二價金屬鹽的二價金屬為選自由儀、巧、鋪及鋒組 成的組中的一種或一種W上的金屬。
[0037] [4]
[003引上述前處理劑，其中，使抗凝血酶III與上述前處理劑共存時，來自上述二價金屬 鹽的二價金屬離子的濃度為0. 5mMW上。
[0039]巧]
[0040] 上述前處理劑，其中，上述整試驗的測定對象物質(zhì)為內(nèi)毒素。
[0041] [6]
[0042] 一種抗凝血酶III用的整試劑盒，其包含上述前處理劑。
[00 創(chuàng)[7]
[0044] 一種付之整試驗的抗凝血酶III的前處理方法，其包括：在與上述前處理劑共存 的狀態(tài)下，將抗凝血酶III供至使蛋白質(zhì)失活的處理中。
[0045][引
[0046] 上述前處理方法，其中，使上述蛋白質(zhì)失活的處理為熱處理或酸處理。
[0047] [9]
[0048] 上述前處理方法，其中，上述熱處理在超過50°C的溫度下進行。
[0049] [10]
[0化0] 上述前處理方法，其中，用于上述酸處理的酸為鹽酸。
[0化1] [11]
[0化2] -種測定抗凝血酶III中的整試驗的測定對象物質(zhì)的方法，其包括；利用上述前 處理方法對抗凝血酶III進行前處理；W及將經(jīng)前處理的抗凝血酶III付之整試驗。
[0化3] [12]
[0化4]一種制造抗凝血酶III的方法，其包括；利用上述方法測定抗凝血酶III中的整試 驗的測定對象物質(zhì)。
【附圖說明】
[0055] 圖1是示出使用平行線定量法的試驗的結果的圖。
[0056] 圖2是示出使用平行線定量法的試驗的結果的圖。
[0057] 圖3是示出使用平行線定量法的試驗的結果的圖。
【具體實施方式】
[0化引 （1)本發(fā)明的前處理劑
[0化9] 本發(fā)明的前處理劑是含有二價金屬鹽的、付之整試驗的ATIII用的前處理劑。本 發(fā)明的前處理劑用于在將ATIII付之整試驗前，在與本發(fā)明的前處理劑共存的狀態(tài)下，將 該ATIII供至使蛋白質(zhì)失活的處理中。
[0060] 此處所說的"整試驗"是指，利用整試劑檢測（測定）祀標物質(zhì)的試驗。也將該祀 標物質(zhì)稱為"整試驗的測定對象物質(zhì)"。整試驗的測定對象物質(zhì)只要是能夠通過整試驗檢測 的物質(zhì)就沒有特別限制，優(yōu)選為化或BG、更優(yōu)選為化。
[006U此處所說的"ATIII"只要是含有ATIII的試樣就沒有特別限制，可W為由ATIII構成的物質(zhì)，也可W為包含ATIIIW外的成分的物質(zhì)。對ATIII的形狀也沒有特別限制，例 如可W為液態(tài)，也可W為冷凍干燥物、粉末、顆粒、片劑等固態(tài)。
[006引作為ATIII，例如可W舉出ATIII的注射用制劑。作為該種注射用制劑，具體來說 可W舉出例如Neuart(注冊商標；株式會社Benesis制）、Ansuronbin(財團法人化學及血 清療法研究所制）、Nont虹on(注冊商標；日本制藥株式會社制）。在將該種ATIII的注射 用制劑付之本發(fā)明的前處理和整試驗時，可W直接將原液用作待測物，也可W將濃縮后的 溶液用作待測物，還可W將用水或緩沖液等水性溶劑W任意倍率稀釋而成的溶液用作待測 物。此處所說的"原液"是指，W通常將ATIII用作注射用制劑時的濃度50化it/mL的濃度 含有的溶液。"原液"例如如下得到；根據(jù)各ATIII的注射用制劑的所附文件中記載的方法， 將ATIII溶解于水性溶劑中，從而得到。此處所說的"濃縮后的溶液"是指，W超過50化it/ mL的濃度含有ATIII的溶液。作為"濃縮后的溶液"，例如可W舉出在各ATIII的注射用制 劑的制造工序中得到的中間純化物。
[0063] 另外，關于用水性溶劑稀釋原液時的稀釋倍率，只要能夠檢測整試驗的測定對象 物質(zhì)就沒有特別限制，例如優(yōu)選為超過1倍且小于64倍、更優(yōu)選為超過1倍且為16倍W下、 進一步優(yōu)選為超過1倍且為10倍W下、更進一步優(yōu)選為超過1倍且為4倍W下、特別優(yōu)選 為超過1倍且為2. 5倍W下、極其優(yōu)選為1. 1倍W上且2. 5倍W下、特別極其優(yōu)選為1. 2倍 W上且2. 5倍W下。需要說明的是，此處所說的"稀釋倍率"是指，在本發(fā)明的前處理劑的共 存下進行使蛋白質(zhì)失活的處理的反應液相對于所述"原液"的稀釋的倍率。由此，稀釋倍率 "1倍"是指，在本發(fā)明的前處理劑的共存下進行使蛋白質(zhì)失活的處理的反應液中的ATIII 濃度與所述"原液"的ATIII濃度相同（原液原本的狀態(tài)。不稀釋原液，ATIIIW50化it/ mL的濃度存在）。
[0064] 另外，ATIII也可W為重組蛋白。重組ATII