另外，作為檢測用底物，可W使用合成底物。合成底物只要具有適合于檢測級(jí)聯(lián) 反應(yīng)的進(jìn)行的性質(zhì)就沒有特別限制。作為"適合于檢測級(jí)聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行的性質(zhì)"，例如可W 為用于檢測凝固酶的存在的性質(zhì)、用于檢測級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中間階段的性質(zhì)。作為"用于檢測 凝固酶的存在的性質(zhì)"，可W舉出通過凝固酶的酶反應(yīng)而顯色的性質(zhì)、通過凝固酶的酶反應(yīng) 而發(fā)出巧光的性質(zhì)。作為"用于檢測級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中間階段的性質(zhì)"，可W舉出通過活化C因 子等的酶反應(yīng)而顯色的性質(zhì)、通過活化C因子等的酶反應(yīng)而發(fā)出巧光的性質(zhì)。作為合成底 物，例如可W舉出通式X-Y-Z(式中，X為保護(hù)基，Y為膚，Z為與Y形成了酷胺鍵的色素） 所表示的底物。例如，在包含C因子、B因子及凝固酶原的反應(yīng)體系中存在化等使C因子 活化的物質(zhì)的情況下，通過作為級(jí)聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果所產(chǎn)生的凝固酶的酶反應(yīng)，Y-Z間的酷胺 鍵被切斷，色素Z游離而顯色，或者發(fā)出巧光。在利用含有G因子及凝固酶原的反應(yīng)體系 的情況下、或檢測級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中間階段的情況下，分別通過凝固酶、或在級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中間階 段產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，色素Z發(fā)生游離即可。作為保護(hù)基X，沒有特別限制，可W適當(dāng)?shù)厥褂媚w 的公知的保護(hù)基。作為該種保護(hù)基，可W舉出叔了氧幾基、苯甲酯基。對(duì)色素Z沒有特別 限制，例如，可W為在可見光下被檢測出的色素，也可W為巧光色素。作為色素Z，可W舉出 pNA(對(duì)硝基苯胺）、MCA(7-甲氧香豆素-4-己酸）、DNP化4-二硝基苯胺）、Dansyl(丹橫 酷）系色素。作為膚Y，可W舉出Leu-Gly-Arg(LGR)、Ile-Glu-Gly-Arg(IEGR)(序列號(hào) 1)、 Val-Pro-Arg(VPR)、Asp-Pr〇-Arg(DPR)。該些合成底物均可W用于檢測凝固酶的存在，也可 W用于檢測級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中間階段。另外，該些合成底物也可W根據(jù)檢測對(duì)象選擇使用適當(dāng) 的物質(zhì)。例如，從底物特異性的方面出發(fā)，包含LGR作為膚Y的底物可W適合用于凝固酶的 檢測，包含VH?或DPR作為膚Y的底物可W適合用于活化C因子的檢測。游離的色素Z通 過與色素的性質(zhì)相符的方法進(jìn)行測定即可。
[008引需要說明的是，在使用整血細(xì)胞提取液（LAL)作為整試劑的情況下，可W利用LAL中原本含有的凝固蛋白原作為檢測用底物。另外，也可W將適當(dāng)選擇的檢測用底物與LAL 組合使用。
[0089] 在使用重構(gòu)的整試劑作為整試劑的情況下，可W將適當(dāng)選擇的檢測用底物與重構(gòu) 的整試劑組合使用。
[0090] 各因子及檢測用底物可W作為混合物包含于本發(fā)明的試劑盒中，也可W分別個(gè)別 地或W任意的組合個(gè)別地包含于本發(fā)明的試劑盒中。
[OOW] 通過使用該種本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行ATIII的前處理，可W減少將ATIII付之整試 驗(yàn)時(shí)的反應(yīng)干擾作用，能夠W高精度實(shí)施ATIII的整試驗(yàn)。
[0092] (3)本發(fā)明的前處理方法
[0093] 本發(fā)明的前處理方法為付之整試驗(yàn)的ATIII的前處理方法，其包括；在與本發(fā)明 的前處理劑共存的狀態(tài)下，將ATIII供至使蛋白質(zhì)失活的處理中。
[0094] 此處所說的"使蛋白質(zhì)失活的處理"只要是使ATIII失活的處理即可，具體來說， 只要是W不抑制整試驗(yàn)的程度使ATIII失活的處理即可。作為使蛋白質(zhì)失活的處理，例如 可W舉出熱處理、酸處理、堿處理，但不限定于該些。作為使蛋白質(zhì)失活的處理，可W單獨(dú)進(jìn) 行任一種處理，也可W組合進(jìn)行兩種或兩種W上的處理。
[0095] 使蛋白質(zhì)失活的處理例如可W在水或緩沖液等水性溶劑中進(jìn)行。目P，使蛋白質(zhì)失 活的處理例如可W在使ATIII與本發(fā)明的前處理劑在水性溶劑中共存的狀態(tài)下進(jìn)行。
[0096] 此處所說的"熱處理"是指，對(duì)與本發(fā)明的前處理劑共存的ATIII進(jìn)行加熱的處 理。對(duì)加熱的方法沒有特別限定，優(yōu)選使用加熱塊、水浴、空氣浴、微波爐等設(shè)備的方法。另 夕F，關(guān)于熱處理的溫度，只要蛋白質(zhì)失活就沒有特別限制，例如通常超過5〇°c。熱處理的溫 度例如優(yōu)選為55°C~100°C、更優(yōu)選為55°C~95°C、進(jìn)一步優(yōu)選為60°C~90°C、更進(jìn)一步 優(yōu)選為65°C~85°C、特別優(yōu)選為65°C~75°C。另外，關(guān)于熱處理的時(shí)間，只要蛋白質(zhì)失活 就沒有特別限制，例如優(yōu)選為1分鐘W上。熱處理的時(shí)間例如優(yōu)選為1分鐘~2小時(shí)、更優(yōu) 選為1分鐘~1小時(shí)、進(jìn)一步優(yōu)選為5分鐘~30分鐘、更進(jìn)一步優(yōu)選為5分鐘~20分鐘、 特別優(yōu)選為5分鐘~15分鐘。
[0097] 另外，此處所說的"酸處理"是指，使與本發(fā)明的前處理劑共存的ATIII與酸接觸 的處理。作為用于酸處理的酸，例如可W舉出鹽酸、硫酸、硝酸，但不限定于該些。該些之 中，優(yōu)選鹽酸。酸的添加量可w根據(jù)酸的種類等各種條件適當(dāng)設(shè)定。酸的添加量例如可w為酸處理時(shí)的反應(yīng)體系中的酸濃度達(dá)到0. 00IN~IN、優(yōu)選達(dá)到0. 0IN~0. 5N、更優(yōu)選達(dá)到 0.01N~0. 1N的量。關(guān)于酸處理的時(shí)間，只要蛋白質(zhì)失活就沒有特別限制，例如可W為通常 用于酸處理的時(shí)間。酸處理的時(shí)間例如可W為0. 1秒~2小時(shí)。
[0098] 另外，此處所說的"堿處理"是指，使與本發(fā)明的前處理劑共存的ATIII與堿接觸 的處理。作為用于堿處理的堿，例如可W舉出氨氧化鋼、氨氧化鐘，但不限定于該些。該些 之中，優(yōu)選氨氧化鋼。堿的添加量可W根據(jù)堿的種類等各種條件適當(dāng)設(shè)定。堿的添加量例 如可W為堿處理時(shí)的反應(yīng)體系中的堿濃度達(dá)到0. 001N~1N、優(yōu)選達(dá)到0. 01N~0. 5N、更優(yōu) 選達(dá)到0. 01N~0. 1N的量。關(guān)于堿處理的時(shí)間，只要蛋白質(zhì)失活就沒有特別限制，例如可 W為通常用于堿處理的時(shí)間。堿處理的時(shí)間例如可W為0. 1秒~2小時(shí)。
[0099] 本發(fā)明的前處理方法可W包括使蛋白質(zhì)失活的處理W外的工序。
[0100] 例如，在進(jìn)行使蛋白質(zhì)失活的處理前，可W適當(dāng)對(duì)ATIII進(jìn)行處理。例如，可W進(jìn) 行將ATIII的干燥粉末微粉化等對(duì)ATIII進(jìn)行加工的處理。另外，例如可W對(duì)ATIII進(jìn)行 稀釋或濃縮等。該些處理可W在與本發(fā)明的前處理劑共存前進(jìn)行，也可W在與本發(fā)明的前 處理劑共存后且在進(jìn)行使蛋白質(zhì)失活的處理之前進(jìn)行。
[0101] 另外，例如在進(jìn)行使蛋白質(zhì)失活的處理后，也可W適當(dāng)進(jìn)行后處理。后處理例如為 在將經(jīng)前處理的ATIII付之整試驗(yàn)時(shí)，使整試驗(yàn)不受到抑制的處理。例如，在進(jìn)行熱處理作 為使蛋白質(zhì)失活的處理的情況下，可W降低處理物的溫度。另外，例如在進(jìn)行酸處理作為使 蛋白質(zhì)失活的處理的情況下，可W利用堿將處理物中和。另外，例如在進(jìn)行堿處理作為使蛋 白質(zhì)失活的處理的情況下，可W利用酸將處理物中和。另外，例如也可W對(duì)處理物進(jìn)行稀釋 或濃縮等。
[0102] 通過使用該種本發(fā)明前處理方法進(jìn)行ATIII的前處理，可W減少將ATIII付之整 試驗(yàn)時(shí)的反應(yīng)干擾作用，因此可高精度地實(shí)施ATIII的整試驗(yàn)。
[0103] (4)本發(fā)明的測定方法
[0104] 本發(fā)明的測定方法是測定ATIII中的整試驗(yàn)的測定對(duì)象物質(zhì)的方法，其包括：利 用本發(fā)明的前處理方法對(duì)ATIII進(jìn)行前處理；W及將經(jīng)前處理的ATIII付之整試驗(yàn)。
[0105] 整試驗(yàn)例如可W利用公知的方法進(jìn)行。作為公知的方法，例如可W舉出比色法、比 濁法、凝膠化法。
[0106] 具體來說，整試驗(yàn)可W通過使ATHI與整試劑接觸來進(jìn)行。在ATIII中存在整試驗(yàn) 的測定對(duì)象物質(zhì)的情況下，級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行。由此，通過測定級(jí)聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行，可W測定ATIII 中的整試驗(yàn)的測定對(duì)象物質(zhì)。在整試驗(yàn)時(shí)，各因子可W在使ATIII與整試劑接觸的工序的 最初就包含于反應(yīng)體系中，也可W逐次添加至反應(yīng)體系中。
[0107] 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行可W使用檢測用底物進(jìn)行測定。目P，關(guān)于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行，可W根 據(jù)檢測用底物的種類，通過測定該底物的反應(yīng)（顯色或凝固等）來測定。檢測用底物可W 在任意的時(shí)刻添加至反應(yīng)體系中。例如，檢測用底物可W在使ATIII與整試劑接觸的工序 的最初就包含于反應(yīng)體系中，也可W在該工序的進(jìn)行中或完成后添加至反應(yīng)體系中。另外， 在使用預(yù)先含有檢測用底物的整試劑的情況下，可W不將檢測用底物另行添加至反應(yīng)體系 中。
[0108] 關(guān)于本發(fā)明的測定方法，只要在ATIII中存在整試驗(yàn)的測定對(duì)象物質(zhì)的情況下級(jí) 聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行，則也可w包括其它任意的工序。例如，如上所述，本發(fā)明的測定方法也可w包 括向反應(yīng)體系中添加檢測用底物的工序。另外，例如，本發(fā)明的測定方法也可W包括將通過 測定得到的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為其它數(shù)據(jù)的工序。作為將通過測定得到的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為其它數(shù)據(jù)的工 序，例如可W舉出下述工序；基于通過測定得到的數(shù)據(jù)，計(jì)算出ATIII中的整試驗(yàn)的測定對(duì) 象物質(zhì)的量。
[0109] 本發(fā)明的測定方法中，反應(yīng)優(yōu)選在水或緩沖液等水性溶劑中進(jìn)行。
[0110] 根據(jù)本發(fā)明的測定法，可W減少將ATIII付之整試驗(yàn)時(shí)的反應(yīng)干擾作用，因此可 高精度地實(shí)施ATIII的整試驗(yàn)。
[011U 另外，如此可得到確認(rèn)到不存在整試驗(yàn)的測定對(duì)象物質(zhì)導(dǎo)致的污染的ATIII。良P， 本發(fā)明提供一種制造ATIII的方法，其包括；利用本發(fā)明的測定方法測定ATIII中的整試驗(yàn) 的測定對(duì)象物質(zhì)。如此制造的ATIII能夠W注射劑等任意的形態(tài)提供。
[011引實(shí)施例
[0113] 下面，通過實(shí)施例來具體地說明本發(fā)明，但該些實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明的技術(shù)范圍 進(jìn)行任何限定。需要說明的是，在實(shí)施例中記載的所有試驗(yàn)中，水、試劑、塑料制品及玻璃制 品等均使用可保證未檢測出內(nèi)毒素及不包含對(duì)于整試劑的反應(yīng)的反應(yīng)干擾因子的物質(zhì)。
[0114] 徒t添加回收率的定義〉
[0115] 在利用比色法或比濁法實(shí)施的試驗(yàn)中，按照W下的步驟計(jì)算出化添加回收率。 即，在向ATIII中添加已知量的內(nèi)毒素的待測物的整試驗(yàn)的同時(shí)，代替ATIII而將等量的水 作為待測物而進(jìn)行整試驗(yàn)，將該整試驗(yàn)作為陽性對(duì)照來實(shí)施。將包含ATIII的待測物的吸 光度變化率（mAbs/min)的值除W陽性對(duì)照的吸光度變化率的值，對(duì)所得到值進(jìn)行百分率 換算，作為化添加回收率。需要說明的是，在ATIII或水中存在內(nèi)毒素污染的情況下，從與 污染相當(dāng)?shù)闹禍p去測定值后計(jì)算出Et添加回收率即可。目P，Et添加回收率可W指，在包含 ATIII的待測物中實(shí)際檢測出的化量相對(duì)于不存在ATHI導(dǎo)致的反應(yīng)干擾作用時(shí)應(yīng)當(dāng)檢測 出的化量的比例（％ )。
[0116] <參考例1〉基于稀釋加熱法的ATIII的化添加回收試驗(yàn)
[0117] 向原液、或用水稀釋4倍、16倍、64倍或者256倍的50化it/mL的ATIII制劑 (Neuart(注冊(cè)商標(biāo)）；株式會(huì)社Benesis;W下相同）〇. 4mL中加入制備成0.祀U(xiǎn)/mL的 EtCJPRSE;日本藥典內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物品：W下相同）的標(biāo)準(zhǔn)液〇.〇4mU使用試管混合器劇烈 攬拌1分鐘。之后，將〇.2mL分注至其它容器中，使用加熱塊W7〇°C加熱10分鐘。之后， 將0. 05血分注至微孔板，加入比色法用的化測定試劑巧ndospecy(注冊(cè)商標(biāo)化S-50M;生 化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社；W下相同）0. 〇5mL。接著，使用具有恒溫槽功能和攬拌功能的酶標(biāo)儀 (WellreaderMP-96 ;生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社；W下相同）劇烈攬拌1分鐘后，在37°C-邊加