一種基于分子識(shí)別的熒光檢測(cè)葉酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于分子識(shí)別的熒光檢測(cè)葉酸的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 葉酸是維持生物體正常生命活動(dòng)過(guò)程必不可少的一類(lèi)有機(jī)物質(zhì)，需求量雖少，但 是對(duì)維持健康意義重大。葉酸作為一種輔酶，在細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)，以及嘌呤、嘧啶、核酸、蛋 白質(zhì)的生物合成上發(fā)揮著重要的作用，在治療某些腫瘤和心血管疾病方面也有一定作用。 葉酸缺乏，容易導(dǎo)致生理功能退化及某些疾病如胃腸功能紊亂、智力退化以及神經(jīng)管畸形 的發(fā)生。處于發(fā)育期的機(jī)體、孕婦、哺乳期婦女、嬰兒更加需要補(bǔ)充葉酸；對(duì)于巨幼紅血球性 貧血，葉酸是一種具有顯著療效的藥物。
[0003] 由于葉酸具有特殊的生理功能，特別是對(duì)妊娠期、哺乳期婦女和胎兒，葉酸經(jīng)常作 為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑用于保健食品及配方食品中。因此，如何測(cè)定這些食品中的葉酸含量，以監(jiān)控 這些食品的質(zhì)量就變得尤為重要。
[0004] 測(cè)定葉酸的分析方法主要有流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法，高效液相色譜法，分光光度 法，微生物法以及熒光光度法。經(jīng)典的微生物法檢測(cè)葉酸雖然靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，但是操 作繁瑣，重復(fù)性差，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，容易受到廣泛使用的抗生素的影響，檢測(cè)結(jié)果不能區(qū)分各 種葉酸鹽形式。高效液相色譜法雖然在葉酸分析中應(yīng)用廣泛，但是方法都還不成熟。高效液 相色譜法分離性能很好，但是儀器成本昂貴，同時(shí)使用大量有機(jī)試劑給環(huán)境造成嚴(yán)重污染。 流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)樣品中葉酸含量，重現(xiàn)性較差。
[0005] 三維熒光光譜技術(shù)是近幾十年中發(fā)展起來(lái)的一種新的熒光分子技術(shù)，可以描繪熒 光強(qiáng)度同時(shí)隨激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)變化的關(guān)系圖譜。擁有高靈敏度、高信息量和選擇性的 優(yōu)勢(shì)，廣泛用作光譜指紋分析、臨床分析、多組分分析等。當(dāng)位于基態(tài)的熒光物質(zhì)分子在吸 收了與其相應(yīng)的特征電子能級(jí)一致的光能后，其價(jià)電子將從成鍵或非成鍵軌道躍迀到反鍵 軌道上去，這就是激發(fā)態(tài)產(chǎn)生的本質(zhì)。處于激發(fā)態(tài)的分子，經(jīng)振動(dòng)弛豫和內(nèi)部轉(zhuǎn)換等非輻射 的躍迀形式躍迀到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，由此釋放能量返回基態(tài)，所發(fā)射出的 光輻射就是熒光。物質(zhì)在一定頻率和強(qiáng)度的激發(fā)光照射下，如果光被吸收的比例不太大且 溶液的濃度非常小時(shí)0. 05)，則熒光物質(zhì)的濃度與溶液所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度成正比。分 子中至少具有一個(gè)芳環(huán)或具有多個(gè)共軛雙鍵的有機(jī)化合物易于發(fā)射熒光，具有大的共軛n 鍵結(jié)構(gòu)、給電子取代基和剛性的平面結(jié)構(gòu)的分子可以發(fā)射強(qiáng)熒光。熒光法是分析藥物和食 品中各種維生素的較好方法，具有快速、靈敏、選擇性好的優(yōu)點(diǎn)。但是現(xiàn)有熒光分析法主要 利用強(qiáng)氧化劑氧化葉酸，取得其分解產(chǎn)物產(chǎn)生的熒光，進(jìn)行含量檢測(cè)，操作起來(lái)比較費(fèi)時(shí)費(fèi) 力，過(guò)程繁瑣，另外由于葉酸的不完全分解會(huì)導(dǎo)致干擾較多，重現(xiàn)性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種在不破壞葉酸分子的前提下利用熒光 光譜法快速、有效地檢測(cè)葉酸含量的方法。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：一種基于分子識(shí)別的熒光檢測(cè)葉酸 的方法，其特征在于包括以下步驟：
[0008] 1)合成識(shí)別分子：將乳清酸與1，12-二氨基十二烷水溶液混合，常溫?cái)嚢璺磻?yīng) 80~100小時(shí)得到混合液，將所述混合液除去水分得到濃縮產(chǎn)物，將所述濃縮產(chǎn)物用無(wú)水 乙醇洗滌，真空干燥后得到1，12-二乳清酸基十二烷基二胺鹽（DDO)，其反應(yīng)方程式如下：
[0010] 2)配制標(biāo)準(zhǔn)液：稱(chēng)取磷酸二氫鈉和氫氧化鈉溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)其pH值為7. 0~ 7. 8,得到磷酸緩沖溶液；稱(chēng)取葉酸溶解于磷酸緩沖溶液中，得到葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；稱(chēng)取DDO溶 解于磷酸緩沖溶液中，得到DDO標(biāo)準(zhǔn)溶液；
[0011] 3)測(cè)定三維熒光光譜特定條件：葉酸激發(fā)光波長(zhǎng)為400nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為460nm; DDO激發(fā)光波長(zhǎng)為320nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為390nm;
[0012] 4)測(cè)定熒光強(qiáng)度：在DDO濃度為4.0X10_4m〇l/L，激發(fā)光波長(zhǎng)為320nm，發(fā)射光波 長(zhǎng)為390nm，激發(fā)電壓為800V，激發(fā)光源透過(guò)孔徑均為5.Onm，發(fā)射光源透過(guò)孔徑均為5.Onm 的條件下，改變?nèi)~酸的濃度，測(cè)定不同葉酸濃度下DDO溶液的熒光強(qiáng)度；
[0013] 5)得出線(xiàn)性方程：根據(jù)步驟4)得出DD0溶液的熒光強(qiáng)度（F)與葉酸的濃度（cp) 間具有線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為F= 3116. 99 - 28. 4759cp，相關(guān)系數(shù)y為0. 9959,檢出限為 1. 25Xl(T6m〇l/L;
[0014] 6)取lmL葉酸標(biāo)準(zhǔn)液，依步驟3)的方法測(cè)定熒光值，計(jì)算出葉酸的濃度。
[0015] 進(jìn)一步的，步驟1)中乳清酸與1，12-二氨基十二烷的摩爾比為2:1。
[0016] 進(jìn)一步的，步驟1)中反應(yīng)時(shí)間為95~98小時(shí)。
[0017] 進(jìn)一步的，步驟2)中DD0的溶解為常溫下利用超聲振蕩儀超聲溶解。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是，不需要將葉酸分解就能利用熒光光譜儀檢測(cè)葉酸的含量， 操作過(guò)程簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高，對(duì)采樣量限制小，較少量的樣品就可以達(dá)到檢測(cè)目的， 實(shí)驗(yàn)周期短，實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，成本低。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為葉酸水溶液的三維熒光掃描光譜圖；
[0020] 圖2為葉酸水溶液的熒光強(qiáng)度隨濃度變化趨勢(shì)圖；
[0021] 圖3為DD0水溶液的三維熒光光譜；
[0022] 圖4為DD0緩沖溶液的熒光強(qiáng)度隨濃度的變化趨勢(shì)圖；
[0023] 圖5為緩沖液中的葉酸熒光強(qiáng)度隨DD0濃度的變化趨勢(shì)；
[0024] 圖6為DD0對(duì)葉酸熒光光譜的影響；
[0025] 圖7為葉酸緩沖液的熒光強(qiáng)度隨乳清酸濃度的變化趨勢(shì)；
[0026] 圖8為葉酸對(duì)DD0熒光光譜的影響；
[0027] 圖9為葉酸對(duì)DDO熒光猝滅的Stern-Volmer曲線(xiàn)；
[0028] 圖10為葉酸對(duì)DD0熒光猝滅的雙對(duì)數(shù)曲線(xiàn)；
[0029] 圖11為DD0的熒光強(qiáng)度隨葉酸濃度變化趨勢(shì)。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明， 并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0031] 本發(fā)明的機(jī)理：
[0032] 葉酸的識(shí)別分子為如式（I)所示的1，12-二乳清酸基十二烷基二胺鹽（簡(jiǎn)稱(chēng) DD0)，可以自發(fā)地在水溶液中形成囊泡并產(chǎn)生分子識(shí)別作用。葉酸分子結(jié)構(gòu)具有能與其頭 基產(chǎn)生具有分子識(shí)別作用的三重氫鍵的特點(diǎn)。本發(fā)明通過(guò)熒光光譜法研宄這種bola型兩 親分子1，12-二乳清酸基十二烷基二胺鹽（DD0)表面活性劑與葉酸的相互作用，據(jù)此建立 了在葉酸分子結(jié)構(gòu)不被破壞基礎(chǔ)上的熒光分析法檢測(cè)葉酸新方法。
[0034] 1、葉酸自身熒光性質(zhì)考察
[0035] 利用三維熒光光譜儀考察葉酸三維熒光譜圖，如圖1所示，葉酸具有熒光性，且葉 酸濃度為5.OXKTVol/L，激發(fā)波長(zhǎng)為400nm，發(fā)射波長(zhǎng)為460nm時(shí)具有最大熒光強(qiáng)度。
[0036] 設(shè)定三維熒光光譜儀的激發(fā)波長(zhǎng)為400nm，發(fā)射波長(zhǎng)為460nm，激發(fā)電壓為800V， 光源透過(guò)孔徑為5.Onm，測(cè)定葉酸在不同濃度下的熒光強(qiáng)度。如圖2所示，在25°C的試驗(yàn)溫 度下，葉酸的熒光強(qiáng)度隨著葉酸濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到1. 〇Xl(T3m〇l/L，熒光強(qiáng)度 達(dá)到了一個(gè)平臺(tái)期，直到濃度達(dá)到2.OXl(T3m〇l/L范圍內(nèi)，當(dāng)濃度大于2.OXl(T3m〇l/L時(shí)， 熒光強(qiáng)度隨濃度的增大而減小，葉酸在這個(gè)過(guò)程中發(fā)生了熒光自猝滅現(xiàn)象。
[0037] 葉酸的熒光強(qiáng)度對(duì)pH值很敏感，受緩沖溶液pH值的影響很大，只有在中性或堿性 條件下，葉酸才能顯示出足夠的熒光信號(hào)，結(jié)合人體血液的pH值，本發(fā)明采用pH7. 0~7. 8 的磷酸鹽緩沖液研宄葉酸的熒光行為。
[0038] 2、DD0自身熒光性質(zhì)考察
[0039] 利用三維熒光光譜儀測(cè)定DD0三維熒光譜圖，如圖3所示，DD0具有熒光性，且DD0 的濃度為1. 〇Xl(T3m〇l/L，激發(fā)波長(zhǎng)為320nm，發(fā)射波長(zhǎng)為390nm時(shí)具有最大熒光強(qiáng)度。 [0040] 設(shè)定三維熒光光譜儀的激發(fā)波長(zhǎng)為320nm，發(fā)射波長(zhǎng)為390nm，激發(fā)電壓為800V， 光源透過(guò)孔徑為5.Onm，測(cè)定DD0在不同濃度下的熒光強(qiáng)度。如圖4所示，在25°C的試驗(yàn)溫 度下，DD0緩沖溶液的熒光強(qiáng)度在濃度范圍2.OXl(T4m〇l/L到2.OXl(T3m〇l/L內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān) 系。
[0041] 3、DD0對(duì)葉酸的熒光增強(qiáng)效應(yīng)研宄
[0042] 固定葉酸濃度為5.OXl(T4m〇l/L，改變DD0濃度，測(cè)定不同DD0濃度下的體系熒 光強(qiáng)度以及葉酸發(fā)射波長(zhǎng)隨DD0濃度變化情況。如圖5所示，在25°C的試驗(yàn)溫度下，葉 酸的熒光強(qiáng)度值隨加入DDO分子的濃度增大而增大。隨著DDO的濃度增加，葉酸的熒光 強(qiáng)度先急劇增加（斜率1為1. 06X10 6L/mol)，到達(dá)某一拐點(diǎn)后，緩慢增加（斜率1(2為 2. 65X105L/mol)。該拐點(diǎn)對(duì)應(yīng)的濃度為2. 24Xl(T4m〇l/L，此點(diǎn)恰是DD0的臨界聚集濃度， 說(shuō)明DD0單體狀態(tài)和囊泡聚集體對(duì)葉酸熒光強(qiáng)度的影響不同。如圖6所示，在25°C的試驗(yàn) 溫