度下，在DD0 濃度分別為a= 5.0Xl(r4mol/L、b= 4.5Xl(T4mol/L、c= 4.0Xl(r4mol/ L、d= 3. 5XlCT4mol/L、e= 3. 0XlCT4mol/L、f= 2. 5XlCT4mol/L、g= 2. 0XlCT4mol/L、h =1.5Xl〇-4mol/L、i= 1.0Xl〇-4mol/L、j= 0.5Xl〇-4mol/L、k=Omol/L時(shí)的熒光光譜顯 示，DDO的加入沒有使葉酸最大發(fā)射波長改變，說明與DDO相互作用并不會改變?nèi)~酸發(fā)光基 團(tuán)結(jié)構(gòu)。
[0043] 如圖7所示，在25°C的試驗(yàn)溫度下，乳清酸的加入會使葉酸的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，并且 隨著乳清酸濃度的增加，增強(qiáng)的程度呈線性變化趨勢（斜率K3為1. 79X105L/mol)，這說明 乳清酸與葉酸的頭基形成了多重氫鍵，因而使葉酸的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。
[0044] 4、葉酸對DD0的熒光猝滅作用研宄
[0045] DD0分子也有熒光，固定DD0濃度為4. 0X10_4m〇l/L，選定激發(fā)波長為320nm，發(fā)射 波長390nm，激發(fā)電壓800V，光源透過孔徑5.Onm，在pH7. 4情況下，測定了DD0與不同濃度 葉酸相互作用的熒光發(fā)射光譜。圖8顯示了在25°C的試驗(yàn)溫度下，在葉酸濃度分別為a= 0mol/L、b= 2. 5XlCT6mol/L、c= 5. 0XlCT6mol/L、d= 7. 5XlCT6mol/L、e= 10XlCT6mol/ L、f= 12. 5XlCT6mol/L、g= 15. 0XlCT6mol/L、h= 17. 5XlCT6mol/L、i= 20. 0XlCT6mol/ L、j= 22. 5Xl(T6m〇l/L時(shí)的熒光光譜，DDO的最大發(fā)射波長增大幅度為6nm，發(fā)生輕微紅移， 說明與葉酸相互作用可能會改變DD0發(fā)光基團(tuán)結(jié)構(gòu)。DD0的熒光強(qiáng)度隨著葉酸濃度的增大 而減弱，說明葉酸誘導(dǎo)DD0自身熒光猝滅的發(fā)生。
[0046] 從熒光猝滅機(jī)理看，葉酸對DD0的猝滅可分為動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅是葉酸 和DD0在基態(tài)時(shí)生成復(fù)合物，而導(dǎo)致DD0熒光強(qiáng)度降低；動(dòng)態(tài)猝滅是葉酸和DD0的激發(fā)態(tài)分 子之間的互相作用而誘導(dǎo)的焚光猝滅。假定該猝滅過程是動(dòng)態(tài)猝滅，符合Stern-Volmer方 程：
[0047] F〇/F = l+KqT〇[Q]
[0048] 式中匕和F分別為缺失和存在猝滅劑時(shí)DDO的熒光強(qiáng)度，[Q]為猝滅劑濃度，Kq 為雙分子熒光猝滅速率常數(shù)，T^為沒有猝滅劑存在下熒光分子平均壽命（約為l(r8s)。以 FQ/F對[Q]作圖，如圖9所示，得到方程y= 0. 0114x+0. 9899(R= 0. 9931)。由斜率可得 Kq= 1.MXK^Lmor^s'據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，各類猝滅劑對分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)為 2.OX101(IL?mor1 ?s'而本發(fā)明求得的葉酸對DD0的猝滅過程速率常數(shù)遠(yuǎn)大于最大擴(kuò)散 碰撞猝滅常數(shù)，說明葉酸對DD0的猝滅過程是分子之間結(jié)合成為了基態(tài)復(fù)合物所導(dǎo)致的靜 態(tài)猝滅，而不是因?yàn)榉肿訑U(kuò)散和碰撞所引起的動(dòng)態(tài)猝滅。
[0049] 葉酸對DD0熒光猝滅為靜態(tài)猝滅時(shí)，可以用熒光強(qiáng)度求算結(jié)合常數(shù)Ka與結(jié)合位點(diǎn) 數(shù)n。熒光強(qiáng)度與猝滅劑濃度的關(guān)系滿足lgKa+nlg[Q] =lg^c/F-l)，式中，n為結(jié)合位點(diǎn) 數(shù)，Ka為葉酸和DD0的結(jié)合常數(shù)。在25°C下，以lg(FQ/F-l)對lg[Q]作圖。如圖10所示， 得到方程y= 1. 926x+8. 4683(R= 0. 96132)，求得葉酸與DD0 的結(jié)合常數(shù)Ka= 2. 94X108L/ mol，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n= 1. 926。結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n~ 2說明葉酸在DDO的某兩個(gè)位點(diǎn)上形成了復(fù) 合物，且結(jié)合作用較強(qiáng)。
[0050] 與紫外_可見分光光度法比較，其敏感度可高出2~4個(gè)數(shù)量級，其測定下限通常 可達(dá)0. 1~0.001g/mL。本發(fā)明中，DDO的熒光強(qiáng)度（F)與葉酸的濃度（cp)間存在良好的 線性關(guān)系，如圖11所示，其線性方程F= 3116. 99 - 28. 4759cp，相關(guān)系數(shù)（y)為0? 9959。 葉酸濃度在1. 25Xl(T6m〇l/L仍具有良好的線性關(guān)系，低于此濃度，體系熒光強(qiáng)度變化不明 顯，因此推出檢出限可達(dá)1. 25Xl(T6mol/L。
[0051] 實(shí)施例
[0052] 一種基于分子識別的熒光檢測葉酸的方法，包括以下步驟：
[0053] 1)合成識別分子：將 3. 9025g，2. 5Xl(T2mol的乳清酸與 1. 0018g，5. 0Xl(T3mol的 1，12-二氨基十二烷水溶液中混合，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)80~100小時(shí)得到混合液，在上述時(shí)間范 圍內(nèi)都可反應(yīng)得到混合液，具體的本實(shí)施例中常溫?cái)嚢璺磻?yīng)96小時(shí)得到混合液，真空抽濾 混合液，濾去未反應(yīng)的原料，將混合液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去水分得到濃縮產(chǎn)物，將產(chǎn)物真空干 燥后用無水乙醇洗滌，進(jìn)行二次過濾，過濾得到的固體再次真空干燥后得到乳白色粉末即 為1，12-二乳清酸基十二烷基二胺鹽（DD0)，其反應(yīng)方程式如下：
[0055] 2)配制標(biāo)準(zhǔn)液：稱取7. 8000g磷酸二氫鈉和0. 7720g氫氧化鈉溶于水，用lmol/L 鹽酸調(diào)節(jié)其pH值為7. 0~7. 8,在中性或偏堿性的環(huán)境下，葉酸都能顯示出足夠的熒光信 號因此都可實(shí)施，具體的結(jié)合人體血液pH值，本實(shí)施例調(diào)節(jié)pH值為7. 4,定容至1000mL得 到磷酸緩沖溶液；稱取〇. 2275g葉酸溶解于磷酸緩沖溶液中，定容于100mL棕色容量瓶中， 得葉酸儲備液，移取1. 〇〇mL葉酸儲備液定容于100mL棕色容量瓶中，得到5Xl(T5m〇l/L葉 酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；稱取〇. 04048gDD0溶解于磷酸緩沖溶液中，定容于100mL棕色容量瓶中，得到 8Xl(T4m〇l/LDD0標(biāo)準(zhǔn)溶液，由于DD0在60°C以上的溫度下會發(fā)生膠束聚集體、微極性等各 類變化從而影響溶解性，因此在常溫下借助超聲振蕩儀超聲溶解；
[0056] 3)測定熒光強(qiáng)度：在DD0濃度為4.OXl(T4m〇l/L，激發(fā)光波長為320nm，發(fā)射光波 長為390nm，激發(fā)電壓為800V，光源透過孔徑均為5.Onm的條件下，改變?nèi)~酸的濃度，測定不 同葉酸濃度下DD0溶液的熒光強(qiáng)度，得出DD0溶液的熒光強(qiáng)度（F)與葉酸的濃度（cp)間 具有線性關(guān)系，線性方程為F= 3116. 99 - 28. 4759cp，相關(guān)系數(shù)y為0.9959,檢出限為 1. 25Xl(T6m〇l/L;
[0057] 4)取lmL葉酸標(biāo)準(zhǔn)液，依步驟3)的方法測定焚光值，計(jì)算出葉酸的濃度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于分子識別的熒光檢測葉酸的方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 合成識別分子：將乳清酸與1，12-二氨基十二烷水溶液混合，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)80~ 100小時(shí)得到混合液，將所述混合液除去水分得到濃縮產(chǎn)物，將所述濃縮產(chǎn)物用無水乙醇洗 滌，真空干燥后得到1，12-二乳清酸基十二烷基二胺鹽（DDO)，其反應(yīng)方程式如下：2) 配制標(biāo)準(zhǔn)液：稱取磷酸二氫鈉和氫氧化鈉溶于水，用鹽酸調(diào)節(jié)其pH值為7. 0~7. 8， 得到磷酸緩沖溶液；稱取葉酸溶解于磷酸緩沖溶液中，得到葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；稱取DDO溶解于 磷酸緩沖溶液中，得到DDO標(biāo)準(zhǔn)溶液； 3) 測定三維熒光光譜特定條件：葉酸激發(fā)光波長為400nm，發(fā)射光波長為460nm ;DD0 激發(fā)光波長為320nm，發(fā)射光波長為390nm ; 4) 測定熒光強(qiáng)度：在DDO濃度為4. 0 X 10_4mol/L，激發(fā)光波長為320nm，發(fā)射光波長為 390nm，激發(fā)電壓為800V，激發(fā)光源透過孔徑均為5. Onm，發(fā)射光源透過孔徑均為5. Onm的條 件下，改變?nèi)~酸的濃度，測定不同葉酸濃度下DDO溶液的熒光強(qiáng)度； 5) 得出線性方程：根據(jù)步驟4)得出DDO溶液的熒光強(qiáng)度（F)與葉酸的濃度（cp)間 具有線性關(guān)系，線性方程為F = 3116. 99 - 28. 4759cp，相關(guān)系數(shù)γ為0.9959,檢出限為 I. 25Xl(T6mol/L ; 6) 取ImL葉酸標(biāo)準(zhǔn)液，依步驟3)的方法測定焚光值，計(jì)算出葉酸的濃度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子識別的熒光檢測葉酸的方法，其特征在于：所 述步驟1)中乳清酸與1，12-二氨基十二烷的摩爾比為2:1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子識別的熒光檢測葉酸的方法，其特征在于：所 述步驟1)中反應(yīng)時(shí)間為95~98小時(shí)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于分子識別的熒光檢測葉酸的方法，其特征在于：所 述步驟2)中DDO的溶解為常溫下利用超聲振蕩儀超聲溶解。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于分子識別的熒光檢測葉酸的方法,該方法的步驟包括1)合成識別分子DDO；2)配制磷酸緩沖溶液、葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和DDO標(biāo)準(zhǔn)溶液；3)測定三維熒光光譜特定條件；4)測定熒光強(qiáng)度；5)得出線性方程；6)根據(jù)線性方程計(jì)算葉酸的濃度。本發(fā)明不需要將葉酸分解就能利用熒光光譜儀檢測葉酸的含量，操作過程簡便，重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號】CN104897627
【申請?zhí)枴緾N201510056592
【發(fā)明人】葛炳強(qiáng), 楊利軍, 陳忠秀
【申請人】浙江工商大學(xué)
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年2月4日