微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正標準品及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基于肽質(zhì)量指紋譜的基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜鑒定微生物的技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正標準品及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]病原體的快速、準確識別是臨床感染診斷、傳染病預(yù)防控制、食品安全等公共衛(wèi)生問題的關(guān)鍵因素。隨著軟電離技術(shù)的發(fā)展，基于肽質(zhì)量指紋譜的基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALD1-TOFMS)微生物識別技術(shù)也隨之問世。該技術(shù)是在完整的微生物中添加酸性基質(zhì)輔助細胞裂解，激光激發(fā)細胞裂解物(小蛋白或多肽)形成肽質(zhì)量指紋譜，與已構(gòu)建的屬、種水平的共性參考譜庫進行比對分析，從而實現(xiàn)微生物的鑒定。其快速、自動化、高通量、準確的特性已使其在全球臨床診斷、質(zhì)檢、傳染病監(jiān)測、食品安全等領(lǐng)域占有一席之地。目前商業(yè)化的質(zhì)譜微生物鑒定系統(tǒng)有布魯克公司的Microflex/Auto-B1typer及島津公司的 AXIMA Assurance-SRAMIS/VITEK MS 系統(tǒng)。
[0003]質(zhì)譜儀采集樣本的準確性是肽質(zhì)量指紋譜微生物識別體系的關(guān)鍵因素。而儀器校正用標準品決定質(zhì)譜儀采樣的準確性。目前商業(yè)化的微生物鑒定用質(zhì)譜儀校正標準品只有布魯克公司的Bruker Bacterial Test Standard (BTS255343)。鑒于病原微生物的敏感性，該標準品因涉及病原菌及其提取物，國內(nèi)購進手續(xù)繁瑣、價格昂貴。微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正，不同廠家給出的方案不同。布魯克公司采用大腸桿菌提取物，現(xiàn)用現(xiàn)提，需反復(fù)培養(yǎng)大腸桿菌；且每個用戶使用的菌株不同，對各個實驗室檢測結(jié)果平行性比對造成影響。島津公司采用大腸桿菌8739菌落直接涂抹，菌株需新鮮培養(yǎng)且傳代不超過7次。由于基質(zhì)與菌落直接結(jié)合，結(jié)晶均一性差；且人工涂抹菌落，造成每個樣本點均一性較差。這兩個因素造成校正點穩(wěn)定性不夠好，系統(tǒng)采集譜圖較為困難，校正時間長；譜圖基線較高，在10,000至14，OOODa范圍內(nèi)峰數(shù)明顯減少，尤其大于12，OOODa沒有峰出現(xiàn)，直接造成校正匹配漏點增多，尤其是高質(zhì)量數(shù)的校正峰。以上這些因素均會直接影響微生物的鑒定結(jié)果O

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了彌補目前微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正品難以獲得或者校正過程費時、費力且效果不穩(wěn)定等不足之處，提供一種成本低廉、校正譜圖優(yōu)質(zhì)、校正效果穩(wěn)定的微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正品。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供一種用于微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正的試劑盒。
[0006]本發(fā)明提供的微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正標準品，含有大腸桿菌(Escherichia coli)特征蛋白，該特征蛋白的質(zhì)荷比m/z分別為:2094，2466，3149，4364，5095，5380，6241，6254，6315，6410，6856，7157，7273，7872，8368，9742，10137，10299，12227。
[0007]進一步地，本發(fā)明的微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正標準品通過以下方法制備得到:
[0008](I)選擇大腸桿菌ATCC8739、MG1655、JM109，將三株菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，收集菌株，按照質(zhì)量比3-8:1-5:1-3將三者混合；
[0009]本發(fā)明從85株大腸桿菌中篩選了 9株菌，進一步優(yōu)化組合后確定了 3株菌，即上述的ATCC8739、MG1655、JM109，并優(yōu)化了這3株菌的配比。
[0010](2)按照質(zhì)量體積比5-10mg:0.1-0.5mL向三株大腸桿菌混合物中加入蛋白洗滌液A，再按照與蛋白洗滌液A的體積比5-2:1加入蛋白洗滌液B ;混勻、離心、棄上清；
[0011]所述蛋白洗滌液A為去離子水或超純水；蛋白洗滌液B為無水乙醇；
[0012]優(yōu)選地，步驟(2)是按照質(zhì)量體積比5-10mg:0.2-0.4mL向三株大腸桿菌混合物中加入蛋白洗滌液A，再按照與蛋白洗滌液A的體積比3-2:1加入蛋白洗滌液B ；混勻、離心、棄上清；
[0013](3)向步驟⑵獲得的沉淀中加入蛋白溶解液A，二者的質(zhì)量體積比為5-10mg:0.025-0.125mL，充分混勻后再加入與蛋白溶解液A相同體積的蛋白溶解液B，離心，取上清，即為標準品；
[0014]所述蛋白溶解液A為40 % -80 %的色譜級甲酸，蛋白溶解液B為色譜級乙腈。
[0015]凍干是保持蛋白穩(wěn)定性的良好方法，為了方便保存與運輸，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將本發(fā)明制得的標準品制備為凍干品，通?？梢园疵抗?-20 μ L分裝，凍干。
[0016]其中，步驟⑴中三株菌的質(zhì)量比為4-7:1-4:1-2 ;步驟⑵和步驟(3)的離心均為 10000_13000rpm，2_5min。
[0017]優(yōu)選地，步驟⑴中三株菌的質(zhì)量比為5-6:1-3:1-2 ;步驟⑵和步驟⑶的離心均為 12000rpm，2_3min。
[0018]更優(yōu)選地，步驟(I)中三株菌的質(zhì)量比為5:2:1 ;步驟⑵和步驟(3)的離心均為12000rpm，2min。
[0019]本發(fā)明提供一種用于微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正試劑盒，含有微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正標準品。
[0020]進一步地，所述標準品為凍干品，還含有蛋白?谷解液Α、蛋白?谷解液B和基質(zhì)洛解液，所述為蛋白溶解液A為50 % -80 %的色譜級甲酸，蛋白溶解液B為100 %色譜級乙腈；基質(zhì)溶解液為49 %的乙腈、2.0 %的三氟乙酸、49 %超純水。
[0021 ] 優(yōu)選地，所述為蛋白溶解液A為50 % -70 %的色譜級甲酸。
[0022]本發(fā)明提供了上述微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正標準品或含有該標準品的試劑盒在質(zhì)譜鑒定微生物中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明提供了上述微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正標準品或含有該標準品的試劑盒在應(yīng)用MALD1-TOFMS鑒定微生物中的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明提供的標準品在實際應(yīng)用時，包括以下步驟:
[0025]I)若為非凍干品，可以直接將標準品點于質(zhì)譜樣品靶板上，室溫干燥后在蛋白標準品上覆蓋用基質(zhì)溶解液制備的α -氫基-4-羥基肉桂酸飽和溶液，室溫干燥后進質(zhì)譜使用，
[0026]具體地，標準品I UL點于質(zhì)譜樣品靶板上，室溫干燥后在蛋白標準品上覆蓋IyL用基質(zhì)溶解液制備的α-氫基-4-羥基肉桂酸飽和溶液，室溫干燥后進質(zhì)譜使用；或
[0027]若為凍干品，按照體積比1:1-2加入蛋白溶解液Α，振蕩溶解后加入與蛋白溶解液A等體積的蛋白溶解液B，混勻；取標準品液，點于質(zhì)譜樣品靶板上，室溫干燥后在蛋白標準品上覆蓋用基質(zhì)溶解液制備的α -氫基-4-羥基肉桂酸飽和溶液，室溫干燥后進質(zhì)譜使用；
[0028]在本發(fā)明的一個實施例中，取凍干的標準品I管，加入25 μ L蛋白溶解液Α，振蕩溶解后加入25 μ L蛋白溶解液B，混勻；用移液器取I μ L標準品液，點于質(zhì)譜樣品靶板上，室溫干燥后在蛋白標準品上覆蓋I μ L用基質(zhì)溶解液制備的α -氫基-4-羥基肉桂酸飽和溶液，室溫干燥后進質(zhì)譜使用；
[0029]所述蛋白溶解液A為50 % -80 %的色譜級甲酸，蛋白溶解液B為色譜級乙腈；
[0030]2)質(zhì)譜采集的參數(shù)設(shè)定:線性陽離子采樣模式，采集質(zhì)荷比范圍2000_20000Da，對于目前商業(yè)化的微生物鑒定用質(zhì)譜儀，源電壓、透鏡電壓、延遲提取時間、激光頻率、采集譜圖掃描數(shù)目。
[0031]步驟2)中參數(shù)的設(shè)定以各自的要求及儀器狀態(tài)為準。
[0032]本發(fā)明提供了微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正標準品的制備方法，包括以下步驟:
[0033](I)選擇大腸桿菌ATCC8739、MG1655、JM109，將三株菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，收集菌株，按照質(zhì)量比3-8:1-5:1-3將三者混合；
[0034](2)按照質(zhì)量體積比5-10mg:0.1-0.5mL向三株大腸桿菌混合物中加入蛋白洗滌液A，再按照與蛋白洗滌液A的體積比5-2:1加入蛋白洗滌液B ;混勻、離心、棄上清；
[0035]優(yōu)選地，步驟⑵是按照質(zhì)量體積比5-10mg:0.2-0.4mL向三株大腸桿菌混合物中加入蛋白洗滌液A，再按照與蛋白洗滌液A的體積比3-2:1加入蛋白洗滌液B ；混勻、離心、棄上清；
[0036]所述蛋白洗滌液A為去離子水或超純水；蛋白洗滌液B為無水乙醇；
[0037](3)向步驟⑵獲得的沉淀中加入蛋白溶解液A，二者的質(zhì)量體積比為5-