-羥基肉桂酸與菌落直接結(jié)合，結(jié)晶均一性差，系統(tǒng)采集譜圖較為困難，在相同的采集參數(shù)條件下，采用島津公司提供的制備標(biāo)準(zhǔn)品的方法得到的標(biāo)準(zhǔn)品用于分子量校正，其獲得譜圖的時(shí)間為本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)品采集譜圖方法的4-8倍。且譜圖基線較高、在10000至HOOODa范圍內(nèi)峰數(shù)目較本發(fā)明校正標(biāo)準(zhǔn)品明顯減少，尤其大于12000Da沒(méi)有峰出現(xiàn)。
[0069]在系統(tǒng)校正過(guò)程中，直接涂抹新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌ATCC8739菌落作為標(biāo)準(zhǔn)品與系統(tǒng)內(nèi)置校正參考譜的匹配情況不穩(wěn)定:大腸桿菌8739菌落直接涂抹多次校正最佳的匹配是有2個(gè)校正峰無(wú)法匹配:6241.4,12227.3 ;本發(fā)明的校正標(biāo)準(zhǔn)品匹配穩(wěn)定，最佳匹配為I個(gè)校正峰無(wú)法匹配6241.4。除去系統(tǒng)問(wèn)題的6241.4，本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)品校正質(zhì)譜分子量的方法在高分子量范圍的12227.3Da有很好的匹配，這對(duì)微生物鑒定采集范圍(2000-20000Da)內(nèi)的校正非常關(guān)鍵。
[0070](2)Microflex 系統(tǒng)
[0071]布魯克公司的Microflex質(zhì)譜系統(tǒng)，采用FlexControl軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。采集參數(shù)為:線性陽(yáng)離子模式；采集的質(zhì)量范圍為2000-20000Da;源I電壓，20kV，源2電壓，18.5kV，透鏡電壓，8.45kV ;延時(shí)提取，320ns ;激光頻率，20.0Hz，80shots采集一個(gè)樣品結(jié)晶點(diǎn)，平均每個(gè)樣本結(jié)晶點(diǎn)采集8次，共計(jì)640shots形成一張譜圖。布魯克公司推薦用大腸桿菌乙醇/甲酸預(yù)提取方法進(jìn)行儀器校正，其提取方法是用300uL的超純水懸溶一接種環(huán)菌落，而后加入900uL的無(wú)水乙醇，1000rpm離心3min，棄上清。在沉淀中加入10uL 70%的甲酸溶液、10uL乙腈，1000rpm離心3min，取上清。
[0072]本發(fā)明采用發(fā)明實(shí)例2制得的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系統(tǒng)校正，相同采集條件下用本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行系統(tǒng)校正和比較。從肽質(zhì)量譜來(lái)看，布魯克公司推薦的儀器校正方法譜圖中的峰數(shù)目明顯低于本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)蛋白峰數(shù)目，尤其在大于1000Da的高分子量范圍(圖2)。布魯克公司推薦的標(biāo)準(zhǔn)品校正在偏差小于300ppm時(shí)，在微生物鑒定肽譜范圍內(nèi)有4個(gè)校正肽段沒(méi)有匹配:4364、5095、7157、10137 ;本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)蛋白在同樣質(zhì)量范圍能全部匹配。
[0073]實(shí)施例4標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性評(píng)價(jià)
[0074]將本發(fā)明實(shí)施例2制備的標(biāo)準(zhǔn)蛋白真空凍干后保存于-80°C冰箱內(nèi)。每月定時(shí)抽取，用標(biāo)準(zhǔn)品溶解液A、標(biāo)準(zhǔn)品溶解液B按要求溶解，時(shí)長(zhǎng)為I年。采用布魯克公司的Microflex質(zhì)譜系統(tǒng)、FlexControl軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。采集參數(shù)為:線性陽(yáng)離子模式；質(zhì)量范圍為2000-20000Da ;源I電壓，20kV，源2電壓，18.5kV，透鏡電壓，8.45kV ;延時(shí)提取，320ns ;激光頻率，20.0Hz, 10shots采集一個(gè)樣品結(jié)晶點(diǎn)，平均每個(gè)樣本結(jié)晶點(diǎn)采集5次。結(jié)果顯示，在I年的時(shí)長(zhǎng)內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白譜沒(méi)有顯著變化，在相同的采集條件下，峰圖、標(biāo)準(zhǔn)肽段峰強(qiáng)度均沒(méi)有明顯變化(圖3)，校正效果穩(wěn)定。
[0075]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于，含有大腸桿菌(Escherichiacoli)特征蛋白，該特征蛋白的質(zhì)荷比m/z分別為:2094，2466，3149，4364，5095，5380，6241，6254，6315，6410，6856，7157，7273，7872，8368，9742，10137，10299，12227。2.如權(quán)利要求1所述的標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于，通過(guò)以下方法制備得到: (1)選擇大腸桿菌ATCC8739、MG1655、JM109，將三株菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，收集菌株，按照質(zhì)量比3-8:1-5:1-3將三者混合； (2)按照質(zhì)量體積比5-10mg:0.1-0.5mL向三株大腸桿菌混合物中加入蛋白洗滌液A，再按照與蛋白洗滌液A的體積比5-2:1加入蛋白洗滌液B ;混勻、離心、棄上清； 所述蛋白洗滌液A為去離子水或超純水；蛋白洗滌液B為無(wú)水乙醇； (3)向步驟(2)獲得的沉淀中加入蛋白溶解液A，二者的質(zhì)量體積比為5-10mg:0.025-0.125mL，充分混勻后再加入與蛋白溶解液A相同體積的蛋白溶解液B，離心，取上清即為標(biāo)準(zhǔn)品； 所述蛋白溶解液A為50 % -80 %的色譜級(jí)甲酸，蛋白溶解液B為色譜級(jí)乙腈。3.如權(quán)利要求2所述的標(biāo)準(zhǔn)品，其特征在于，步驟(I)中三株菌的質(zhì)量比為4-7:1-4:1-2 ;步驟(2)和步驟(3)的離心均為 10000_13000rpm，2_5min。4.一種用于微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求1-3任一所述的標(biāo)準(zhǔn)品。5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)品為凍干品，還含有蛋白溶解液A、蛋白溶解液B和基質(zhì)溶解液，所述蛋白溶解液A為50 % -80 %的色譜級(jí)甲酸，蛋白溶解液B為100%色譜級(jí)乙腈；基質(zhì)溶解液為49%的乙腈、2.0%的三氟乙酸、49%超純水。6.權(quán)利要求1-3任一所述的標(biāo)準(zhǔn)品或權(quán)利要求4-5任一所述的試劑盒在質(zhì)譜鑒定微生物中的應(yīng)用。7.權(quán)利要求1-3任一所述的標(biāo)準(zhǔn)品或權(quán)利要求4-5任一所述的試劑盒在應(yīng)用MALD1-TOF MS鑒定微生物中的應(yīng)用。8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟: 1)取權(quán)利要求1-3任一所述的標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)于質(zhì)譜樣品靶板上，室溫干燥后在蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上覆蓋用基質(zhì)溶解液制備的α -氫基-4-羥基肉桂酸飽和溶液，室溫干燥后進(jìn)質(zhì)譜使用，或 取權(quán)利要求4-5任一所述試劑盒中凍干的標(biāo)準(zhǔn)品I管，按照體積比1:1-2加入蛋白溶解液A，振蕩溶解后加入與蛋白溶解液A等體積的蛋白溶解液B，混勻；取標(biāo)準(zhǔn)品液，點(diǎn)于質(zhì)譜樣品靶板上，室溫干燥后在蛋白標(biāo)準(zhǔn)品上覆蓋用基質(zhì)溶解液制備的α -氫基-4-羥基肉桂酸飽和溶液，室溫干燥后進(jìn)質(zhì)譜使用； 所述蛋白溶解液A為50 % -80 %的色譜級(jí)甲酸，蛋白溶解液B為色譜級(jí)乙腈； 2)質(zhì)譜采集的參數(shù)設(shè)定:線性陽(yáng)離子采樣模式，采集質(zhì)荷比范圍2000-20000Da，對(duì)于目前商業(yè)化的微生物鑒定用質(zhì)譜儀，源電壓、透鏡電壓、延遲提取時(shí)間、激光頻率、采集譜圖掃描數(shù)目。9.微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)選擇大腸桿菌ATCC8739、MG1655、JM109，將三株菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，收集菌株，按照質(zhì)量比3-8:1-5:1-3將三者混合； (2)按照質(zhì)量體積比5-10mg:0.1-0.5mL向三株大腸桿菌混合物中加入蛋白洗滌液A，再按照與蛋白洗滌液A的體積比5-2:1加入蛋白洗滌液B ;混勻、離心、棄上清； 所述蛋白洗滌液A為去離子水或超純水；蛋白洗滌液B為無(wú)水乙醇； (3)向步驟(2)獲得的沉淀中加入蛋白溶解液A，二者的質(zhì)量體積比為5-10mg:0.025-0.125mL，充分混勻后再加入與蛋白溶解液A相同體積的蛋白溶解液B，離心，取上清即為標(biāo)準(zhǔn)品； 所述蛋白溶解液A為50 % -80 %的色譜級(jí)甲酸，蛋白溶解液B為色譜級(jí)乙腈。10.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)中三株菌的質(zhì)量比為4-7:1-4:1-2 ;步驟(2)和步驟(3)的離心均為 10000_13000rpm，2_5min。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種微生物鑒定用質(zhì)譜儀分子量校正標(biāo)準(zhǔn)品及其制備方法與應(yīng)用，涉及微生物肽質(zhì)量指紋譜的基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明基于基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，通過(guò)對(duì)多種大腸桿菌的組合與優(yōu)化，提供一種依據(jù)多種大腸桿菌的優(yōu)化肽序列，以該序列譜為基礎(chǔ)構(gòu)建適用于目前商業(yè)化質(zhì)譜微生物鑒定系統(tǒng)的校正標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明提供的標(biāo)準(zhǔn)品制備方法簡(jiǎn)單、成本低廉，利用其作為微生物鑒定的質(zhì)譜儀分子量校正標(biāo)準(zhǔn)品，具有穩(wěn)定性好、便于操作、校正時(shí)間短、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，且校正峰的肽序列豐富，準(zhǔn)確度高，能夠解決目前微生物鑒定用質(zhì)譜儀校正標(biāo)準(zhǔn)品獲得困難或操作條件苛刻的問(wèn)題，具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景。
【IPC分類】G01N1/28, G01N27/62
【公開(kāi)號(hào)】CN104931572
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510246677
【發(fā)明人】肖迪, 張建中, 張慧芳, 孟凡亮
【申請(qǐng)人】中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所
【公開(kāi)日】2015年9月23日
【申請(qǐng)日】2015年5月14日