生物檢材中鉤吻素甲和鉤吻素子的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于生物樣品檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種生物檢材中鉤吻素甲和鉤吻素子的 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鉤吻，又名大茶藥、斷腸草等，是馬錢科胡蔓藤屬的全草，產(chǎn)于浙江、福建、廣 東、廣西、貴州、云南等地。鉤吻全株有毒，根、莖、葉均含有生物堿，以根部含量最高，根皮 最高，該類植物因其是毒性極強(qiáng)，多用于外用，應(yīng)用不當(dāng)或誤服可致中毒，有時還可致命。 國內(nèi)鉤吻主要毒性成分是鉤吻堿，有從鉤吻中可以分離出鉤吻素子（Koumine)、鉤吻素甲 (Geliemine)、鉤吻素寅（Kouminicine)、鉤吻素卯（Kouminidine)、鉤吻素辰（Kounidine)、 鉤吻素丙（Sempervirine)、鉤吻素丁（Koumicine)和鉤吻素戊（Koumidine)等生物堿。因 產(chǎn)地不同所含的生物堿的種類和含量也略有差異，廣東產(chǎn)的鉤吻根中曾分離得到鉤吻素 子、卯、丁和戊；而福建產(chǎn)的分離到了鉤吻素甲、丁、子、卯、戊、己等生物堿。其中鉤吻素子含 量最高。國外鉤吻所含化學(xué)成分與國內(nèi)的鉤吻存在差異。如北美產(chǎn)鉤吻除與國內(nèi)鉤吻某些 相同的化學(xué)成分外含量相差很大，以鉤吻素甲為主要成分含量最高。鉤吻中毒主要抑制延 髓呼吸中樞，并抑制腦和脊髓的運(yùn)動中樞。臨床表現(xiàn)以呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主，可出 現(xiàn)呼吸衰竭和呼吸肌麻痹，是鉤吻中毒最常見的死因。
[0003] 鉤吻素子（左）和鉤吻素甲（右）結(jié)構(gòu)式如下：
[0004]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種生物樣品中鉤吻素甲和鉤吻素子的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/ MS)檢驗(yàn)方法，適用于生物樣品（血、尿、肝、腎等）中鉤吻素甲和鉤吻素子的定性定量檢驗(yàn)， 也適用于體外樣品和可疑物證的檢驗(yàn)。
[0006] 本發(fā)明的原理是以空白樣品和添加樣品作對照，按平行操作的要求，對生物樣品 進(jìn)行提取、凈化及濃縮后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，以保留時間（Rt)、質(zhì)譜特征 離子碎片峰和相對豐度作為定性判斷依據(jù)；與平行操作的添加標(biāo)準(zhǔn)品響應(yīng)值比較，根據(jù)峰 面積之比，用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。
[0007] 具體的，本發(fā)明一方面的目的在于提供一種生物檢材中鉤吻素甲和鉤吻素子的液 相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0008] a)樣品前處理：取生物液體樣品1. OmL~2. OmL或生物組織樣品1. 0g~2. 0g剪 碎于具塞試管中；上述樣品加一定量的氫氧化鈉溶液調(diào)p!19~10,加入5. OmL~10.0 mL乙 酸乙酯，振蕩l〇min，高速離心10min ;分離有機(jī)相后，加有機(jī)溶劑進(jìn)行第二次提取，合并兩 次有機(jī)相，置于50°C濃縮儀上揮干；殘渣用500 y L~1000 y L初始流動相定容，過0. 22 y m 微孔有機(jī)濾膜，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析；
[0009] b)樣品分析：
[0010] 色譜柱：kinetex C18 ;進(jìn)樣量：lyL~10yL;流動相：A為含0. 1%甲酸的10mM 甲酸銨【本發(fā)明0. 1%甲酸的10mM甲酸銨是指：濃度為l〇mmol/L的甲酸銨水溶液中甲酸的 體積分?jǐn)?shù)為〇. 1 %，以下不再贅述】，B為甲醇；梯度洗脫【本發(fā)明中的A、B均為體積分?jǐn)?shù)，以 下不再贅述】：〇? 2min，A 為 95%，B 為 5% ;3. Omin，A 為 5%，B 為 95% ;5. Omin，A 為 5%，B 為 95% ;5. lmin，A 為 95%，B 為 5% ;7.0min，A 為 95%，B 為 5% ;流速為 0.5mL/min;
[0011] 離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描（ESI+);檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM);電噴霧電壓：5500V ;離子源溫度：650°C ;霧化氣壓力：55psi ;氣簾氣壓力：50psi ; 輔助氣壓力：50psi。
[0012] 在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，尤其是對于新鮮血液樣品，其中a)樣品前處理還 能夠替換為：取生物液體樣品1. OmL~2. OmL或生物組織樣品1. 0g~2. 0g剪碎于具塞試 管中；加入pH 5. 8磷酸鹽緩沖液3mL~5mL，充分混旋，超聲15min，8000r/min以上高速 離心20min，取上清液待過柱；取3CC HLB固相小柱依次以3mL甲醇、3mL水活化，將離心后 的上清液分別過柱，流速為〇. 5mL/min~1. OmL/min ;再以3mL去離子水和3ml0. 5%甲醇 水溶液【本發(fā)明中〇. 5%甲醇水溶液是指：甲醇水溶液中甲醇的體積分?jǐn)?shù)為0. 5%，以下不 再贅述】先后淋洗小柱；用2mL甲醇洗脫，收集洗脫液置于50°C快速濃縮儀上吹干，殘渣用 500 y L~1000 y L初始流動相定容，過0. 22 y m微孔有機(jī)濾膜，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì) 譜儀分析。
[0013] 在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方式中，其中a)樣品前處理步驟中，還包括另取3份 相同基質(zhì)的空白樣品，1份作為空白樣品，另2份添加鉤吻素甲和鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)100ng制備 成添加樣品；或者還包括另取相同基質(zhì)的空白樣品兩份，分別添加相應(yīng)目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品（添 加量應(yīng)與樣品粗測量相近）制備成添加樣品，混勻。
[0014] 在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方式中，液體樣品為血液、尿液、唾液；所述組織樣品 為肝臟、腎臟。
[0015] 在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方式中，C18柱為3. 0mmX 50mm，2. 6 y m柱或等效色譜 柱。
[0016] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，取液體樣品1.0mL-2.OmL;或者組織樣品 1. 0g-2. 0g〇
[0017] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，乙酸乙酯的加入量為5. 0mL-10.OmL。
[0018] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，殘渣用500yL-1000yL初始流動相定容。
[0019] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，磷酸鹽緩沖液的加入量為3mL-5mL。
[0020] 本發(fā)明另一方面的目的在于提供生物樣品中鉤吻素甲和鉤吻素子的液相色 譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS)檢驗(yàn)方法的應(yīng)用，應(yīng)用于法庭科學(xué)領(lǐng)域，尤其是應(yīng)用于生物樣品 中鉤吻素甲和鉤吻素子的定性定量檢驗(yàn)，以及適用于體外樣品和可疑物證的檢驗(yàn)。
[0021] 優(yōu)選地，所述生物樣品為血、尿、肝、腎。
[0022] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明樣品處理采用液液萃取或者固相萃取，操作簡單， 樣品用量少；采用LC-MS/MS靈敏度高，能有效的排除假陽性，定性、定量準(zhǔn)確度高。
【附圖說明】
[0023] 圖1表示鉤吻素甲和鉤吻素子液相色譜_質(zhì)譜提取離子流圖；
[0024] 圖2表示鉤吻素甲液相色譜-質(zhì)譜提取離子流圖；
[0025] 圖3表示鉤吻素子液相色譜-質(zhì)譜提取離子流圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)施例1定性分析
[0027] 1、試劑
[0028] 本發(fā)明試驗(yàn)用水為一級水（見GB/T 6682-2008規(guī)定）：
[0029] a)磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉為分析純；
[0030] b)甲醇、乙腈、甲酸銨、甲酸、乙酸乙酯均為色譜純；
[0031]C)磷酸鹽緩沖液（pH 5. 8):取磷酸二氫鉀8. 34g與磷酸氫二鉀0. 87g，，分別置于 1000mL容量瓶中，加一級水溶解、稀釋至刻度；
[0032] d)含0. 1%甲酸的10mM醋酸銨：稱取0. 384g的醋酸銨，加入一定量的一級水溶 解，并加入〇. 5mL甲酸混勻，將混合液用一級水稀釋至500mL ;
[0033] e)標(biāo)準(zhǔn)溶液：
[0034] 1)鉤吻素甲和鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精確稱取鉤吻素甲和鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)品各 50mg，分別于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，配制成1. Omg/mL鉤吻素甲和 鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)儲備液，冷藏保存6個月；
[0035] 2)鉤吻素甲和鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)工作液：精確量取1. 0mg/mL鉤吻素甲和鉤吻素子標(biāo) 準(zhǔn)儲備液各10mL，分別于100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成0. 10mg/mL的鉤吻素 甲和鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)工作液，冷藏保存1個月。試驗(yàn)中所用其它濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液均從上述儲 備溶液用甲醇稀釋而得，冷藏保存為1個月。
[0036] 2、儀器和材料
[0037] a)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI)和三重四極桿質(zhì)量分析器；
[0038] b)電子天平：感量0?lmg和0? 01g;
[0039] c)高速離心機(jī)；
[0040] d)振蕩器；
[0041] e)濃縮儀；
[0042] f)移液器：量程 10yL~100yL，100yL~1000yL，1000yL~5000yL;
[0043] g) pH試紙：范圍1~14 ;
[0044] h)固相萃取小柱：HLB固相萃取柱或等效固相小柱；
[0045] i)微孔有機(jī)濾膜：0? 22ym。
[0046] 3、樣品