萃取
[0047] 3. 1、液液萃取
[0048] 取血液等液體樣品1.OmL~2.OmL或肝等組織樣品1. 0g~2. 0g剪碎于具塞試管 中。另取3份相同基質(zhì)的空白樣品，1份作為空白樣品，另2份添加鉤吻素甲和鉤吻素子標(biāo) 準(zhǔn)100ng制備成添加樣品，混勻。
[0049] 上述樣品加一定量的氫氧化鈉溶液調(diào)pH9~10,加入5. OmL~10.0 mL乙酸乙酯， 振蕩10min，高速離心10min。分離有機(jī)相后，加有機(jī)溶劑進(jìn)行第二次提取，合并兩次有機(jī) 相，置于50°C濃縮儀上揮干。殘?jiān)?00 yL~1000 yL初始流動(dòng)相定容，過(guò)0.22 ym微孔 有機(jī)濾膜，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。
[0050] 3. 2、固相萃?。ㄟm用于新鮮血液）
[0051] 按3. 1項(xiàng)制備好樣品，加入pH5. 8磷酸鹽緩沖液3mL~5mL，充分混旋，超聲 15min，8000r/min以上高速離心20min，取上清液待過(guò)柱。取3CC HLB固相小柱依次以3mL 甲醇、3mL水活化，將離心后的上清液分別過(guò)柱，流速為0. 5mL/min~1. OmL/min ;再以3mL 去離子水和3ml0. 5%甲醇水溶液【本發(fā)明中0. 5%甲醇水溶液是指：甲醇水溶液中甲醇的 體積分?jǐn)?shù)為〇. 5%，以下不再贅述】先后淋洗小柱；用2mL甲醇洗脫，收集洗脫液置于50°C快 速濃縮儀上吹干，殘?jiān)?00 y L~1000 y L初始流動(dòng)相定容，過(guò)0. 22 y m微孔有機(jī)濾膜， 濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。
[0052] 4、儀器檢測(cè)
[0053] 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀條件
[0054] 以下為參考條件，可根據(jù)不同品牌儀器和不同樣品等實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整：
[0055] 色譜柱：kinetex C18 (3. OmmX 50mm，2. 6 y m 柱或等效色譜柱；
[0056] 流動(dòng)相及梯度洗脫條件見(jiàn)表1 ;
[0057] 表1流動(dòng)相和梯度洗脫條件
[0058]
[0059] 進(jìn)樣量：1uL~10uL;
[0060] 掃描方式：正離子掃描（ESI+);
[0061] 檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM);
[0062] 電噴霧電壓：5500V;
[0063] 離子源溫度：650°C ;
[0064] 霧化氣壓力：55psi ;
[0065] 氣簾氣壓力：50psi ;
[0066] 輔助氣壓力：50psi ;
[0067] 監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓、碰撞能參見(jiàn)表2。
[0068] 表2監(jiān)測(cè)離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能
[0069]
[0070] 5、記錄和計(jì)算
[0071] 記錄各樣品及標(biāo)準(zhǔn)品平行進(jìn)樣2~3次中目標(biāo)物的保留時(shí)間及峰面積值，按公式 (1)計(jì)算回收率：
[0072]
[0073] 式中：
[0074] R-回收率；
[0075] A添一添加樣品中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積平均值；
[0076] W純一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度，單位為微克每毫升（yg/mL);
[0077] V添一添加樣品的定容體積，單位為毫升（mL);
[0078] A純一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積平均值；
[0079] M添一添加樣品中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的添加量，單位為微克（yg)。
[0080] 6、定性結(jié)果評(píng)價(jià)
[0081] 6.1、陰性結(jié)果評(píng)價(jià)
[0082] 如果樣品未出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品Rt值相同的色譜峰，且添加樣品相應(yīng)目標(biāo)物的回收率 在60%以上，則陰性結(jié)果可靠。
[0083] 如果添加樣品中未出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品Rt值相同的色譜峰或回收率低于60%，則陰性 結(jié)果不可靠。
[0084] 如果添加樣品的添加含量< 0. 02 y g/mL時(shí)，可不計(jì)算回收率，則陰性結(jié)果按以下 方式評(píng)價(jià)：
[0085] 如果案件樣品未出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品Rt值相同的色譜峰，添加樣品的色譜峰信噪比大 于10,則陰性結(jié)果可靠。
[0086] 如果添加樣品中未出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品Rt值相同的色譜峰或添加樣品的色譜峰的信噪 比小于等于10,則陰性結(jié)果不可靠。
[0087] 6. 2陽(yáng)性結(jié)果評(píng)價(jià)
[0088] 如果樣品中出現(xiàn)與目標(biāo)物相同的兩對(duì)定性離子對(duì)，其色譜峰保留時(shí)間與添加樣品 中目標(biāo)物的色譜峰保留時(shí)間比較，相對(duì)誤差在±2. 5%之內(nèi)，且所選擇的相對(duì)離子對(duì)豐度比 與添加樣品中的相對(duì)離子對(duì)豐度比之相對(duì)誤差不超過(guò)表3規(guī)定的范圍，空白樣品中未出現(xiàn) 相應(yīng)的色譜峰，則陽(yáng)性結(jié)果可靠。相關(guān)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖參見(jiàn)圖1~圖3。
[0089] 如果空白樣品中出現(xiàn)與添加樣品中目標(biāo)物保留時(shí)間一致的色譜峰，且定性離子對(duì) 及相對(duì)豐度一致，則陽(yáng)性結(jié)果不可靠。
[0090] 本發(fā)明中鉤吻素子、鉤吻素甲在血樣中的檢出限為0. 2ng/mL。
[0091] 表3定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差
[0092]
[0093] 實(shí)施例2定量分析
[0094] 1、試劑同實(shí)施例1
[0095] 2、儀器與材料同實(shí)施例1
[0096] 3、樣品萃取
[0097] 準(zhǔn)確量取案件樣品1.OmL~2.OmL或1. 0g~2. 0g平行兩份；另取相同基質(zhì)的空 白樣品兩份，分別添加相應(yīng)目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品（添加量應(yīng)與案件樣品粗測(cè)量相近）制備成添加 樣品，混勻。其他同實(shí)施例1。
[0098] 4、儀器檢測(cè)同實(shí)施例1
[0099] 5、記錄和計(jì)算
[0100] 5. 1、計(jì)算藥物含量
[0101] 記錄各樣品平行進(jìn)樣2~3次中目標(biāo)物峰面積值，按公式（2)計(jì)算含量：
[0102]
[0103] 式中：
[0104] W-單位質(zhì)量樣品中目標(biāo)物質(zhì)的含量，單位為微克每克（yg/g)或微克每毫升 (y g/mL)；
[0105] A樣一樣品中目標(biāo)物的峰面積平均值；
[0106] M添一添加樣品中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的添加量，單位為微克（yg);
[0107] V樣一樣品的定容體積，單位為毫升（mL);
[0108] A添一添加樣品中目標(biāo)物的峰面積平均值；
[0109] M樣一樣品的取樣量，單位為克（g)或毫升（mL);
[0110] V添一添加樣品的定容體積，單位為毫升（mL)。
[0111] 5. 2、計(jì)算相對(duì)相差
[0112] 記錄兩份平行操作的樣品含量，按公式（3)計(jì)算相對(duì)相差：
[0113]
[0114] 式中：
[0115] RD -相對(duì)相差；
[0116] XI、X2 -兩份樣品平行定量測(cè)定的含量數(shù)值；
[0117] Z-兩份樣品平行定量測(cè)定含量的平均值。
[0118] 6、定量結(jié)果評(píng)價(jià)
[0119] 如果案件樣品中目標(biāo)物含量的RD > 20%，定量數(shù)據(jù)不可靠。如果目標(biāo)物含量的 RD< 20%，定量數(shù)據(jù)可靠。其含量按兩份案件樣品的平均值計(jì)算。
[0120] 實(shí)施例3利用非新鮮血液對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)
[0121] 1、試劑，同實(shí)施例1。
[0122] 2、儀器和材料，同實(shí)施例1。
[0123] 3、樣品萃取
[0124] 分別取空白的非新鮮血液1.OmL于具塞試管中；分別添加鉤吻素甲和鉤吻素子標(biāo) 準(zhǔn)品制備成添加樣品，混勻。
[0125] 上述樣品中分別加一定量的氫氧化鈉溶液調(diào)pHIO,加入10.0 mL乙酸乙酯，振蕩 lOmin，高速離心10min。分離有機(jī)相后，加有機(jī)溶劑進(jìn)行第二次提取，合并兩次有機(jī)相（對(duì) 二次提取后的無(wú)機(jī)相進(jìn)行高效液相色譜分析，樣品的提取率為98. 1% )，置于50°C濃縮儀 上揮干。殘?jiān)?000 y L初始流動(dòng)相定容，過(guò)0. 22 y m微孔有機(jī)濾膜，濾液供液相色譜-串 聯(lián)質(zhì)譜儀分析。
[0126] 4、儀器檢測(cè)
[0127] 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀條件
[0128] 以下為參考條件，可根據(jù)不同品牌儀器和不同樣品等實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整：
[0129] 色譜柱：kinetex C18 (3. OmmX 50mm，2. 6 y m 柱或等效色譜柱；
[0130] 流動(dòng)相及梯度洗脫條件見(jiàn)表1 ;
[0131] 表1流動(dòng)相和梯度洗脫條件
[0132]
[0133] 進(jìn)樣量：lyL ~10yL;
[0134] 掃描方式：正離子掃描（ESI+);
[0135] 檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM);
[0136] 電噴霧電壓：5500V;
[0137] 離子源溫度：650°C;
[0138] 霧化氣壓力：55psi;
[0139] 氣簾氣壓力：50psi;
[0140] 輔助氣壓力：50psi;
[0141] 監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓、碰撞能參見(jiàn)表2。
[0142] 表2監(jiān)測(cè)離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能
[0143]
[0144] 鉤吻素甲添加濃度分別為50ng/m